DNA功能化組裝及其在生物分子檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、早期診斷和早期治療是改善癌癥患者的預(yù)后及降低其死亡率的關(guān)鍵所在。腫瘤標(biāo)志物在其中發(fā)揮著重要作用。除了傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，近年來(lái)許多新的且有效的生物分子標(biāo)志物也相繼被學(xué)者發(fā)現(xiàn)，其中包括基因甲基化、多種基因突變、端粒酶、血中循環(huán)DNA及microRNA。眾多研究表明，以上幾種生物分子標(biāo)志物對(duì)癌癥早期診斷及預(yù)測(cè)的敏感性，特異性均不低于傳統(tǒng)標(biāo)志物。因此，上述幾種標(biāo)志物極可能被廣泛用于臨床上對(duì)癌癥的早期診斷、判斷預(yù)后、和評(píng)價(jià)治療效果。針對(duì)這一研究目

2、的，本論文旨在研究DNA與貴金屬納米粒子，熒光、電化學(xué)活性物質(zhì)等信號(hào)分子及生物大分子的組裝方法，利用其對(duì)信號(hào)分子的高負(fù)載量以及可以在其不同位點(diǎn)同時(shí)精確組裝幾種不同生物分子的特性，設(shè)計(jì)合成了多種DNA納米生物探針，構(gòu)建生物分子標(biāo)志物高靈敏、多組分同時(shí)檢測(cè)的新方法。本論文的主要內(nèi)容如下:
　　1.金納米粒子手性二聚體用于檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及其抑制劑
　　利用DNA誘導(dǎo)金納米粒子進(jìn)行手性組裝和限制性內(nèi)切酶HpaⅡ檢測(cè)DNA甲

3、基轉(zhuǎn)移酶活性及其抑制劑。首先，研究粒子尺寸和粒子間距對(duì)手性金納米粒子二聚體手性信號(hào)的影響，篩選出手性信號(hào)最強(qiáng)的金納米粒子二聚體作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)探針。然后利用限制性內(nèi)切酶HpaⅡ可以識(shí)別并切斷二聚體之間的5'-CCGG-3'核酸序列，從而破壞二聚體結(jié)構(gòu)，手性信號(hào)減弱。如果有甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssⅠ存在時(shí)，5'-CCGG-3'DNA序列被甲基化為5'-CCmGG-3'，限制性內(nèi)切酶HpaⅡ無(wú)法切斷此甲基化序列，因而完整的金納米粒子二

4、聚體依然保持很強(qiáng)的手性信號(hào)。該方法具有寬的線性范圍（0.5U mL-1到150U mL-1）、低的檢測(cè)限(0.27U mL-1)、高的選擇性及良好的穩(wěn)定性。同時(shí)，也用此方法評(píng)估了5-氮雜胞嘧啶核苷和普魯卡因?qū)谆D(zhuǎn)移酶的抑制效果?？偟膩?lái)說(shuō)，此方法具有較好的準(zhǔn)確度，特異性，靈敏度，可以檢測(cè)血清樣本，有益于臨床診斷和藥物開發(fā)。
　　2.金納米粒子手性二聚體用于檢測(cè)8-羥基脫氧鳥苷
　　以8-羥基脫氧鳥苷的核酸適體組裝的金納米粒子

5、手性二聚體為信號(hào)探針，檢測(cè)DNA氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物:8-羥基脫氧鳥苷。首先利用8-羥基脫氧鳥苷的核酸適體組裝金納米粒子二聚體。透射電鏡TEM可以觀察到金納米粒子二聚體的生成，CD光譜儀可以檢測(cè)到此二聚體具有很強(qiáng)的手性信號(hào)。當(dāng)溶液中含有檢測(cè)物8-羥基脫氧鳥苷時(shí)，檢測(cè)物會(huì)與其核酸適體結(jié)合，從而破壞二聚體結(jié)構(gòu)，手性信號(hào)減弱。通過(guò)此方法可以定量檢測(cè)0.05nM到2nM的8-羥基脫氧鳥苷，最低檢測(cè)線為33pM（信噪比為3）。同時(shí)，此方法可用于評(píng)

6、估人血清樣本中8-羥基脫氧鳥苷的含量?？偟膩?lái)說(shuō)，此方法具有較好的準(zhǔn)確度，特異性，靈敏度，可以檢測(cè)血清樣本，有益于臨床診斷。
　　3.DNA正四面體探針用于端粒酶活性的電化學(xué)檢測(cè)
　　以DNA正四面體納米材料為基礎(chǔ)，研究其在電化學(xué)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物端粒酶中的應(yīng)用。在DNA正四面體的一個(gè)頂點(diǎn)引出端粒擴(kuò)增引物，其他三個(gè)頂點(diǎn)修飾巰基，通過(guò)金硫鍵將此探針共價(jià)修飾到金電極表面。當(dāng)端粒酶存在時(shí)，端粒酶特異性識(shí)別端粒引物，并在其3'末端擴(kuò)增出(

7、TTAGGG)x富G序列。該富G序列在鉀離子和氯化血紅素的作用下形成G-四鏈體，是一種具有類似辣根過(guò)氧化物酶催化性質(zhì)的DNA模擬酶。該DNA模擬酶在過(guò)氧化氫的存在下催化苯胺聚合成具有電化學(xué)活性的聚苯胺。利用示差脈沖伏安法檢測(cè)聚苯胺的電化學(xué)信號(hào)從而檢測(cè)端粒酶活性。通過(guò)調(diào)節(jié)DNA正四面體探針的尺寸，可以控制相鄰端粒引物的距離。當(dāng)此距離接近端粒酶的尺寸時(shí)，端粒酶識(shí)別端粒引物并進(jìn)行擴(kuò)增的效率大大增強(qiáng)，從而可以得到最佳的電化學(xué)輸出信號(hào)，顯著提高檢

8、測(cè)靈敏度。利用此方法，可以評(píng)估MCF-7，A549，MDA-MB-231，HeLa等細(xì)胞中的端粒酶活性。該方法的最低檢測(cè)限為1個(gè)細(xì)胞/10微升，檢測(cè)范圍為5到5000個(gè)細(xì)胞，與單鏈端粒引物探針相比，信號(hào)提高20倍。該方法用于檢測(cè)膀胱癌患者尿樣中脫落細(xì)胞的端粒酶活性時(shí)，得到的結(jié)果與臨床病理檢測(cè)結(jié)果一致。
　　4.基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)同時(shí)檢測(cè)三種與肺癌相關(guān)microRNA
　　設(shè)計(jì)三種不同熒光素(Cy3，Cy3.5，Cy5)

9、標(biāo)記的核酸探針，對(duì)應(yīng)識(shí)別三種microRNA（miRNA-155，miRNA-182，miRNA-197），形成雙螺旋核酸探針。核酸染料TOTO-1可以嵌入到核酸探針骨架中，通過(guò)單波長(zhǎng)激發(fā)，將熒光共振能量轉(zhuǎn)移給相應(yīng)的熒光素，產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)多組分檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物microRNA。顯著提高相關(guān)腫瘤診斷的準(zhǔn)確度。核酸染料TOTO-1本身在溶液中幾乎不發(fā)出熒光信號(hào)，但當(dāng)它嵌入到雙鏈核酸骨架中時(shí)，其熒光信號(hào)顯著提高約1000倍。其發(fā)射光譜

10、與Cy3，Cy3.5，Cy5的激發(fā)光譜重疊，可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)。miRNA-155，miRNA-182，miRNA-197作為肺癌發(fā)病早期的標(biāo)志物，在血漿中同時(shí)診斷出三種microRNA的存在，可以顯著提高疾病診斷的準(zhǔn)確度，為臨床上疾病的早期診斷提供有效途徑。因此多組分檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物microRNA在生物醫(yī)學(xué)和臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　5.金納米粒子比色法檢測(cè)甲型流感病毒H3N2
　　金納米粒子表面功能化修飾

11、抗血凝素單克隆抗體(mAb)，得到mAb-AuNPs探針。mAb-AuNPs探針通過(guò)抗血凝素單克隆抗體特異性識(shí)別甲型流感病毒囊膜表面富含的血凝素，從而得到探針/病毒組裝體。該探針/病毒組裝體上的金納米粒子相鄰很近，容易產(chǎn)生等離子共振耦合(SPR)效應(yīng)，在紫外可見光譜上表現(xiàn)為金納米粒子的最大吸收峰發(fā)生紅移，裸眼可見組裝體的溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。同時(shí)，利用透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)對(duì)探針/病毒組裝體進(jìn)行表征。在最佳