轉錄因子HOXB7對多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展的影響及其機制的研究.pdf

1、背景：
　　多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種中老年人多見的疾病，而且它是目前認為無法治愈的一種血液系統(tǒng)腫瘤，一般表現為惡性漿細胞的增生，同時還伴有骨痛、乏力等其他非特異性的臨床癥狀，早期一般不易被發(fā)現，它一般可以侵犯骨骼，出現骨質的損害，同時也可以出現其他器官的損傷，其他臟器也會不同程度的累及，如甲狀腺、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，如果侵犯到心臟及肺臟時，甚至可以侵犯到心包或胸腔等組織，從而進一步引起全身多臟器損害，進一步引起代謝的紊亂，以及免

2、疫功能的異常[1]?，F階段，我們主要采取化學治療和造血干細胞的移植的方法治療多發(fā)性骨髓瘤。雖然目前有各種新藥的出現，緩解率及生存率有所提高，但最終會病情復發(fā)，但對于患者來說患者生存質量有待提高，長期生存不理想，同時由于病情反復、進展導致治療效果差，同時腫瘤的易侵襲性，加之多發(fā)耐藥這一普遍現象的存在，同時還有其他因素等原因，迫使我們要更深入的研究多發(fā)性骨髓瘤的新的致病基因及發(fā)病機制，來提升患者的治療療效。難治導致的治療失敗需要我們尋求新的

3、細胞信號傳導通路及致病因素以找到新的治療靶點，因為腫瘤極容易復發(fā)及侵襲性的特點，更需要找到影響浸潤、進展的致病基因及相關轉錄因子。故目前我們研究的焦點在防止腫瘤進展、浸潤上。
　　目前大多數研究認為多發(fā)性骨髓瘤與血管新生有關，它的發(fā)生、發(fā)展及髓外浸潤與相關的細胞信號傳導通路失活有關，同時與異常的細胞生物遺傳學有關，既往研究表明多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生是一種多因素的事件，這些因素相互關聯，相互影響及作用促進瘤細胞的生成及腫瘤的進程。多發(fā)性

4、骨髓瘤的明確的致病因素目前需要進一步深入探討，在研究的過程當值，發(fā)現了許多基因的高表達或者是某些特定基因的低表達，這些基因的異常表達可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有密切關系。資料顯示，有一些細胞因子的分泌會直接刺激骨髓瘤細胞生長及增殖，這些細胞因子常常位于瘤細胞中或者微環(huán)境中的基質細胞中，目前認為與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病關系較密切的細胞因子有：血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶(MMPs)，如MMP-2與MMP-9，同時還發(fā)現以下細胞因子

5、對瘤細胞有促進增殖及浸潤的作用，包括：成纖維生長因子（bFGF）、白介素-8、血管生成素-1、骨橋蛋白(OPN)等。這些細胞因子可能受到某些細胞信號的刺激后，會分泌有所增加，同時與某些特定的癌基因相互作用，它們均有促進血管新生作用[2]。國內外的一些研究已經證實HOXB7基因可特異性誘導bFGF、GROa、VEGF等血管生長因子表達水平上調,激活PI3K/Akt信號傳導途徑，抑制內皮細胞的凋亡，然后進一步促進腫瘤血管生成、腫瘤的生長與轉

6、移。HOXB7基因促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及腫瘤細胞的血管生成等作用，在多種實體腫瘤細胞中已經得到證實，而其在造血系統(tǒng)腫瘤及造血細胞中的作用尚不清楚，關于HOXB7是否與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生以及骨髓瘤的進展、浸潤相關的資料較少，故是我們所研究的重點。
　　因此，本文研究了轉錄因子HOXB7在不同臨床分期的多發(fā)性骨髓瘤患者中的作用，同時檢測了一系列相關基因的表達，為了更深入的明確HOXB7因子的作用，并了解HOXB7因子是否與多

7、發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤相關。同時通過HOXB7-siRNA瞬時轉染多發(fā)性骨髓瘤細胞，使HOXB7因子的表達降低，從而對其他相關基因進行分子生物學的檢測，比較轉染前后表達的變化，明確多發(fā)性骨髓瘤致病基因，并為進一步治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論基礎，從而闡述HOXB7基因可能與骨髓瘤的進展密切相關。
　　國內外關于HOXB7與多發(fā)性骨髓瘤的關系方面，這一領域的研究相對較少，在此研究中，我們發(fā)現HOXB7基因在一部分多發(fā)性骨髓瘤患者中有

8、表達，同時存在表達的患者容易出現病情進展及髓外浸潤，具有潛在的促血管新生及促進細胞增殖的作用，對多發(fā)性骨髓瘤的病情進展有促進作用。通過siRNA轉染多發(fā)性骨髓瘤細胞，使HOXB7基因下調，檢測其他相關基因的表達情況，進一步說明它在多發(fā)性骨髓瘤中的作用，尋找治療多發(fā)性骨髓瘤的新的靶點。把研究分為三部分：
　　第一部分：轉錄因子HOXB7在多發(fā)性骨髓瘤患者中的臨床意義
　　目的：
　　應用實時熒光定量PCR的方法檢測多發(fā)性

9、骨髓瘤患者中HOXB7mRNA及其應用Westernblot的方法檢測其蛋白水平，闡述它在多發(fā)性骨髓瘤中的作用機制，并且純化分離多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓單個核細胞，并分析MM患者中HOXB7因子在不同的多發(fā)性骨髓瘤臨床階段的情況，明確HOXB7與骨髓瘤的進展及髓外浸潤的關系。
　　方法：
　　采用CD138抗體把MM細胞進行分離純化臨床收集的49例MM患者骨髓單個核細胞，并同時取患者骨髓組織及骨髓上清液，采用20例缺鐵性貧血患

10、者作為對照組，將患者按Durie-Salmon分期和是否伴有髓外浸潤進行分組，進行分析。應用免疫組化的方法進行骨髓組織的化學染色，并用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測HOXB7的表達，Western blot法測定其蛋白表達水平，用ELISA的方法檢測骨髓上清液中的蛋白含量
　　結果：
　　1.49例MM患者中，其中有35例MM患者表達HOXB7 mRNA，其表達水平為（0.466±0.148），20例對照組的表達水

11、平為（0.179±0.061），二者相比有顯著差異（P＜0.01）。
　　我們應用Durie-Salmon分期，把MM患者分為兩組。Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期。其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者組21例，HOXB7 mRNA表達水平為（0.372±0.131）。Ⅲ期MM患者組28例，HOXB7 mRNA表達水平為（0.561±0.099），并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組分別與對照組做比較，結果顯示有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM

12、患者組進行比較后，結果顯示差異顯著（P=0.018；P<0.05）。
　　在所有MM患者的標本中行WNT5A mRNA的檢測，結果發(fā)現WNT5A mRNA的表達水平為：（0.588±0.225），對照組的表達水平為（0.192±0.011），Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組的表達水平分別為（0.426±0.133），（0.751±0.176），兩者相比后顯示，差異顯著（P=0.005；P<0.01），與對照組比較后結果顯示P<0.01，差

13、異顯著，有統(tǒng)計學意義。
　　在所有MM患者的標本中行VEGFA,MMP2,bFGF,MMP9,CyclinD1mRNA的表達水平的檢測，Ⅰ+Ⅱ期患者的表達水平分別為（0.826±0.327），（1.726±0.462），（1.026±0.215），（0.735±0.109），（1.726±0.319），Ⅲ期MM患者組為（1.204±0.662），（2.336±0.421），（2.273±0.406），（2.261±0.520），（

14、1.836±0.402），與對照組比較（P<0.05），把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進行比較后，結果顯示差異顯著（P<0.01）。
　　2.在III期MM患者中，其中伴有髓外浸潤的患者有9例，不伴有髓外浸潤的患者有19例，其中伴有髓外浸潤的患者的HOXB7mRNA的表達為（0.751±0.176），不伴有髓外浸潤的HOXB7mRNA患者表達為（0.639±0.051），經過統(tǒng)計學分析顯示差異顯著（P<0.05），WNT5A

15、 mRNA在伴有髓外浸潤的患者的表達為（0.896±0.105），不伴有髓外浸潤的患者表達為（0.605±0.056）。二者與對照組相比有統(tǒng)計學意義，（P<0.01）。二者相比，統(tǒng)計學分析有顯著差異（P<0.05）。
　　3.根據NCCN指南里治療多發(fā)性骨髓瘤中，多發(fā)性骨髓瘤患者的治療的療效標準，把多發(fā)性骨髓瘤患者分為newly diagnosed，sCR，CR，VGPR，PR，SD，progressive disease，cli

16、nical relapse，and relapse from CR.對MM患者行Western blot的檢測。Newly diagnosed（初治）MM患者20例，sCR MM患者5例，CR MM患者3例，VGPR MM患者1例,PR MM患者2例,SD MM患者5例，共計16例病情穩(wěn)定的患者，progressive disease MM患者3例,clinical relapse MM患者6例，relapse from CR MM患者

17、4例，共計13例復發(fā)及病情進展的MM患者。
　　在49例MM患者選取Newly diagnosed、（sCR及CR、VGPR、PR、SD）MM患者、（progressive disease，clinical relapse，and relapse from CR） MM患者各6例，對照組選取10例，其中10例對照組HOXB7蛋白平均表達水平為（0.075±0.026），18例MM患者的HOXB7蛋白的平均表達水平為（0.268±0

18、.127），其中Newly diagnosed組HOXB7蛋白的平均表達水平為（0.278±0.050），（sCR及CR、VGPR、PR、SD）組MM患者與（progressivedisease，clinical relapse，and relapse from CR） MM患者組HOXB7蛋白的平均表達水平為分別為（0.199±0.039），（0.327±0.131）。初治的MM患者與復發(fā)、病情進展的MM患者，分別與病情穩(wěn)定的MM患者

19、相比較，結果顯示有差異顯著（P<0.01)。而把初治MM患者與復發(fā)及病情進展的MM患者相比較后，結果顯示無統(tǒng)計學意義（P>0.05)。初治患者組、復發(fā)及病情進展的MM患者分別與對照組比較，結果有顯著差異（P<0.01）。
　　在選取的這些患者中其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者組6例，HOXB7平均表達水平為（0.216±0.047）。Ⅲ期MM患者組12例，HOXB7蛋白平均表達水平為（0.320±0.114），并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組分別

20、與對照組做比較，結果顯示有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進行比較后，結果顯示差異顯著（P<0.01）。
　　WNT5A蛋白在Ⅰ+Ⅱ期MM患者的平均表達水平為（0.398±0.136），Ⅲ期MM患者組平均表達水平為（0.549±0.142），與對照組表達水平有顯著差異P<0.05，二者比較有統(tǒng)計學意義P<0.01。
　　4.對Newly diagnosed、（sCR及CR、VGPR、PR、S

21、D）MM患者、（progressive disease，clinical relapse，and relapse from CR）MM患者各6例行WNT5a，VEGFA，MMP-2，β-catenin，MMP-9，CyclinD1，survivin蛋白的檢測，其中MMP-2、β-catenin、VEGFA、MMP-9蛋白在Newly diagnosed和（progressive disease，clinical relapse，and

22、relapse from CR） MM患者中的平均表達水平明顯高于（sCR及CR、VGPR、PR、SD） MM患者中的平均表達水平，經統(tǒng)計學分析，差異顯著（P<0.01），與對照組比較，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5.我們按照多發(fā)性骨髓瘤的患者是否伴有髓外浸潤，將所有的多發(fā)性骨髓瘤患者分為兩組。把12例III期MM患者中4例無髓外浸潤的MM患者和8例伴髓外浸潤的MM患者檢測HOXB7蛋白水平，平均表達水平分別為（0.265

23、±0.085）和（0.389±0.051），分別與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計學意義，二者之間比較，有明顯差異（P<0.05）。WNT5A蛋白在無髓外浸潤的MM患者中的平均蛋白水平為（0.441±0.075），伴髓外浸潤的MM患者的WNT5A蛋白平均表達水平（0.673±0.0.185）,分別與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計學意義，二者之間比較，有明顯差異（P<0.01）。二者經過統(tǒng)計學分析顯示（P<0.01）,差異顯著。
　　6.

24、免疫組化染色HOXB7、VEGFA、β-catenin、WNT5a蛋白
　?、倜庖呓M化染色HOXB7蛋白結果：在I+II期患者中，有1例顯示低表達，陽性率為5％，有2例高表達，陽性率為10%，在III期患者中，有5例呈現低表達水平，10例患者為高表達，陽性率分別為，17.9%，35.7%，兩組MM患者經統(tǒng)計學分析有明顯差異，（P<0.01）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。在20例對照組中病例中有1例表達陽性，陽性

25、率為5%，與對照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　?、诿庖呓M化染色VEGFA蛋白結果：在I+II期患者中，有3例顯示低表達，陽性率為14.2%，有4例高表達，陽性率為16%，在III期患者中，有7例呈現低表達水平，11例患者為高表達，陽性率分別為，25%，39.3%，兩組MM患者經統(tǒng)計學分析有明顯差異，（P<0.05）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。在20例對照組中病例中有2例表達陽性，陽性率為10%，與對

26、照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　?、勖庖呓M化染色β-catenin蛋白結果：在I+II期患者中，有1例顯示低表達，陽性率為5%，沒有高表達，陽性率為0%，在III期患者中，有3例呈現低表達水平，5例患者為高表達，陽性率分別為10.7%，17.9%，兩組MM患者經統(tǒng)計學分析有明顯差異，（P<0.01）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。對照組中無陽性表達，與對照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　　

27、④免疫組化染色WNT5a蛋白結果：在I+II期患者中，有3例顯示低表達，陽性率為14.2%，高表達患者有4例，陽性率為16%，在III期患者中，有7例呈現低表達水平，11例患者為高表達，陽性率分別為25%，39.3%，兩組MM患者經統(tǒng)計學分析有明顯差異，（P<0.01）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。對照組中2例陽性表達，與對照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　　應用Pearson相關分析結果顯示，HOXB

28、7蛋白與WNT5A蛋白呈正相關，HOXB7蛋白與VEGFA蛋白呈正相關。
　　7.用ELISA的方法檢測骨髓上清液
　　在所有MM患者中，檢測骨髓上清中IL-6、VEGF、MMP-2、MMP-9 CyclinD1、β-catenin蛋白含量，結果顯示蛋白平均含量明顯高于對照組,兩者進行統(tǒng)計學分析，差異顯著(P<0.05)。初治與復發(fā)進展MM患者IL-6蛋白含量明顯高于病情穩(wěn)定MM患者，進行統(tǒng)計學分析顯示差異顯著(P<0.05

29、)；
　　結論：
　　HOXB7基因及蛋白與WNT5a基因與蛋白在多發(fā)性骨髓瘤患者的不同分期中表達水平不同，III期的MM患者的表達較高。初治MM患者、復發(fā)及病情進展MM患者的表達水平與病情穩(wěn)定患者比較有差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。二者在在髓外浸潤的患者中表達高于無髓外浸潤的MM患者，考慮MM患者中如果存在HOXB7與WNT5a表達，可能容易出現髓外浸潤或者進展，故其表達水平可能與MM患者疾病的進展有關，并促進血管新

30、生及髓外浸潤。此外在高表達的HOXB7與WNT5a的患者中，伴隨其他促血管新生及促細胞增殖的相關指標的表達。
　　第二部分：轉錄因子HOXB7促進多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226增殖及應用小干擾RNA后對RPMI8226細胞的影響
　　目的：
　　應用瞬時轉染的方法，采用HOXB7-siRNA轉染RPMI8226細胞，使HOXB7基因表達下降，進一步探討HOXB7基因對RPMI8226細胞增殖影響的機制，明確HOXB

31、7基因在RPMI8226細胞株中的作用。
　　方法：
　　采用瞬時轉染的方法，把特異的HOXB7-siRNA進行轉染至RPMI8226細胞，抑制細胞內HOXB7基因的表達。應用熒光定量PCR（FQ-PCR）方法檢測HOXB7 mRNA水平以及WNT5A mRNA，MMP-2 mRNA，MMP-9 mRNA，β-catenin mRNA表達水平變化。并采用Western Blot的方法檢測上述蛋白水平。轉染后使用MTT的方法檢

32、測小干擾RNA對細胞活力的影響；同時應用流式細胞儀檢測小干擾RNA對細胞周期的影響；
　　結果：
　　1.HOXB7-siRNA在轉染RPMI8226細胞株48h后，HOXB7 mRNA表達水平明顯受到抑制，HOXB7-siRNA轉染組的表達水平為0.329±0.047，negative control-siRNA轉染組為0.985±0.136，HOXB7-siRNA轉染組的表達水平分別與陰性對照組和空白對照相比，差異顯著，

33、有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.用Western blot法檢測HOXB7蛋白表達水平，轉染24小時，HOXB7-siRNA轉染組的蛋白表達水平為0.068±0.002，negative control-siRNA轉染組的蛋白表達水平為0.619±0.118，HOXB7-siRNA轉染組的表達水平分別與陰性對照組和空白對照相比，存在明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　3.HOXB7-siRNA轉染RPMI8

34、226細胞后RPMI8226細胞增殖影響MTT法檢測RPMI8226細胞轉染后的生長情況。通過繪制生長曲線，細胞轉染 HOXB7-siRNA48h，細胞的生長抑制較明顯， negative control-siRNA轉染組和HOXB7-siRNA轉染組OD490值比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　4.HOXB7-siRNA轉染RPMI8226細胞后細胞周期的變化。細胞周期分析顯示HOXB7-siRNA轉染RPMI8226細胞

35、48h后，細胞阻止于G2期，處于G0/G1期細胞比例降低，G2/M期和S期細胞比例升高，凋亡峰顯示凋亡的細胞比例增加。
　　5.HOXB7-siRNA轉染RPMI8226細胞后48h，未轉染組、陰性對照轉染組、HOXB7-siRNA組，HOXB7 mRNA相對表達水平分別為1.058±0.341；1.128±0.315；0.142±0.045，negative control-siRNA組和HOXB7-siRNA組相比有統(tǒng)計學意義

36、（P<0.01）。
　　MMP-2 mRNA相對表達水平分別為2.606±0.521；1.858±0.186；0.882±0.353（P<0.01）。MMP-9 mRNA相對表達水平分別為1.896±0.653；1.025±0.276；0.457±0.068；（P<0.05）。WNT5a mRNA相對表達水平分別為：1.016±0.195；1.002±0.206；0.507±0.026（P<0.01）。β-catenin mRNA

37、相對表達水平分別1.012±0.205；1.006±0.179；0.682±0.351（P<0.01）。negative control-siRNA和HOXB7-siRNA二組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）
　　6.HOXB7-siRNA轉染RPMI8226細胞后48h，未轉染組、NS-siRNA組、HOXB7siRNA組，HOXB7蛋白相對表達水平分別為0.858±0.204，0.619±0.118和0.068±0.

38、021，negative control-siRNA組與HOXB7-siRNA組相比有顯著性差異（P<0.01）。
　　MMP-2蛋白相對表達水平分別為1.018±0.216；0.734±0.159；0.283±0.114（P<0.01）。MMP-9蛋白相對表達水平分別為1.236±0.253；1.022±0.259；0.453±0.098；（P<0.05）。WNT5a蛋白相對表達水平分別為：1.016±0.129；0.947±0

39、.221；0.207±0.028（P<0.01）。β-catenin蛋白相對表達水平分別1.154±0.205；1.006±0.179；0.682±0.351（P<0.01） negative control-siRNA和HOXB7-siRNA二組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結論：
　　通過小干擾RNA瞬時轉染HOXB7基因后，明顯抑制RPMI8226細胞增殖，而瘤細胞凋亡增加， HOXB7表達水平降低

40、后，WNT5A，MMP-2，MMP-9，β-catenin的表達也降低，可能與HOXB7表達水平降低，并進一步引起凋亡相關基因分子以及是否與WNT信號轉導通路信號分子異常有關。
　　第三部分：人參皂苷Rg3(Rg3)抑制RPMI8226細胞株和U266細胞株增殖的研究
　　目的：
　　研究人參皂苷Rg3對RPMI8226細胞株的增殖影響，并為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論證據，并闡述人參皂苷Rg3發(fā)揮抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞

41、的致病機制。
　　方法：
　　應用CCK-8的方法檢測人參皂苷Rg3對RPMI8226細胞株和U266細胞株增殖抑制作用；采用流式細胞儀檢測人參皂苷Rg3對細胞周期分布；熒光定量PCR（FQ-PCR）和Western Blot的方法，檢測HOXB7mRNA，bcl-2 mRNA，bax mRNA，caspase-9 mRNA，caspase-8 mRNA和caspase-3 mRNA及蛋白水平的變化
　　結果：

42、　　1.CCK-8的方法檢測人參皂苷Rg3對人類多發(fā)性骨髓瘤細胞株增殖抑制的影響。人參皂苷Rg3對U266細胞株和RPMI8226細胞株的抑制作用存在時間-劑量-依賴性，人參皂苷Rg3在80μg/ml作用于U266細胞48 h后，達到最大抑制水平。在一半最大抑制濃度(IC50)值為47.5 mg/mll。人參皂苷Rg3在RPMI8226(IC50=36.8μg/ml)細胞株中比U266細胞有更強的細胞增殖抑制作用。
　　2.流式細

43、胞儀檢測人參皂苷Rg3對細胞周期的影響。用20、40和80μg/ml的Rg3分別處理U266細胞和RPMI8226細胞株，結果顯示在G1期細胞群百分比增加，而S期的細胞群比例下降。然而，Rg3對G2/M期沒有影響。
　　3.Western Blot分析顯示經過Rg3處理U266細胞后，HOXB7蛋白的表達有所降低，bcl-2蛋白的表達有所降低，bax蛋白的表達有所升高，并降低了bcl-2/bax的比率。同時檢測細胞凋亡-相關的蛋白

44、質。Western Blot分析顯示Rg3增加了caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白表達。
　　結論：
　　人參皂苷Rg3能夠明顯抑制U266、RPMI8226的細胞活性與增殖作用，出現有時間-劑量-依賴性。降低了HOXB7的水平，同時增加了凋亡蛋白的表達，并且可能通過調節(jié)細胞周期蛋白-依賴激酶途徑導致細胞周期阻滯在G1期?？紤]Rg3可能促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的凋亡，使Bcl-2/Bax蛋白的平衡失調