HIV-1與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相互作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　?、裥腿祟惷庖呷毕莶《?HIV-1)感染輔助性CD4 T細(xì)胞，并引起CD4 T細(xì)胞減少及免疫功能下降?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療雖然能夠有效控制疾病的進(jìn)展，但由于病毒儲(chǔ)存庫(kù)的持續(xù)存在，導(dǎo)致藥物不能夠?qū)摲腍IV DNA徹底清除。作為HIV最大的儲(chǔ)存庫(kù)靜息CD4 T細(xì)胞，已有研究報(bào)道不需要細(xì)胞的活化，HIV即能夠直接感染靜息CD4 T細(xì)胞，并進(jìn)行整合，進(jìn)而建立潛伏的病毒儲(chǔ)存庫(kù)。然而，HIV感染靜息CD4 T細(xì)胞并建立儲(chǔ)存庫(kù)的方式仍

2、不明確。新的觀點(diǎn)認(rèn)為皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白可作為阻止病毒進(jìn)入靜息細(xì)胞及完成細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的屏障，并初步闡明了病毒在宿主皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白層作用方式。
　　肌動(dòng)蛋白(actin)是生物體中微絲的兩個(gè)單體亞基之一，而微絲則是細(xì)胞骨架三大組成結(jié)構(gòu)之一。肌動(dòng)蛋白以兩種形式存在，即單體和多聚體。單體的肌動(dòng)蛋白是由一條多肽鏈構(gòu)成的球形分子，又稱球狀肌動(dòng)蛋白(globular actin，G-actin)。肌動(dòng)蛋白的多聚體形成肌動(dòng)蛋白絲，稱為纖維狀肌動(dòng)蛋白(fib

3、ros actin，F(xiàn)-actin)。在電子顯微鏡下，F(xiàn)-actin呈雙股螺旋狀。病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞后，其整合前復(fù)合體(preintegration complexes，PIC)必須要轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核才能進(jìn)行整合。PIC通過(guò)多種蛋白直接結(jié)合到F-actin上。這種結(jié)合對(duì)病毒逆轉(zhuǎn)錄及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移過(guò)程起著至關(guān)重要的作用。
　　Yoder等人的研究指出，缺少化學(xué)信號(hào)的刺激或再生性細(xì)胞骨架重組，皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白是相對(duì)穩(wěn)定的，從而對(duì)胞內(nèi)病毒轉(zhuǎn)移起到

4、阻礙作用。為沖破這種局限，HIV利用化學(xué)因子輔助受體來(lái)激活肌動(dòng)蛋白的化學(xué)活性，從而引起病毒進(jìn)入細(xì)胞及入胞后的早期活動(dòng)。Yoder等人利用HIV感染靜息CD4 T細(xì)胞為模型，證明了HIV介導(dǎo)的來(lái)自化學(xué)因子輔助受體CXCR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于HIV感染靜息CD4 T細(xì)胞是必不可少的。進(jìn)一步研究證明，gp120激活的化學(xué)信號(hào)通路可能引起皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)變化，而這種動(dòng)態(tài)變化正是HIV進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的必要條件。
　　對(duì)于HIV-1感染過(guò)

5、程需要的兩個(gè)CD4輔助受體，CCR5和CXCR4，雖然Yoder對(duì)HIV感染靜息T細(xì)胞過(guò)程中CXCR4的作用進(jìn)行詳細(xì)描述。然而，對(duì)于CCR5在HIV感染靜息CD4 T細(xì)胞過(guò)程中是否發(fā)揮相似的作用，至今缺少針對(duì)性的研究。論文一中我們首次證實(shí)了HIV介導(dǎo)CCR5信號(hào)通路能夠激活cofilin的活化，并參與病毒入胞后的早期階段反應(yīng)，尤其是向核轉(zhuǎn)移的過(guò)程，進(jìn)而在靜息細(xì)胞中形成潛在感染。
　　人類CD2分子是普遍存在于所有T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞及

6、NK細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，并介導(dǎo)細(xì)胞間粘附作用。并有報(bào)道顯示，CD2可改變Cofilin的磷酸化狀態(tài);并促進(jìn)活化的Cofilin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。近期也有研究顯示細(xì)胞靜息記憶CD4 T表面高表達(dá)CD2分子可以提示病毒儲(chǔ)存庫(kù)的存在，但對(duì)于CD2信號(hào)能否影響HIV感染靜息CD4 T細(xì)胞的過(guò)程尚不明確。論文二中我們首次證實(shí)了CD2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠引起細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白極化狀態(tài)發(fā)生改變，并且抑制HIV對(duì)靜息CD4 T細(xì)胞的感染過(guò)程。
　　在基礎(chǔ)分子水

7、平上對(duì)HIV與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用機(jī)制的研究，促進(jìn)了病毒發(fā)病機(jī)理的理解。由于這種相互作用對(duì)于HIV-1感染CD4 T細(xì)胞也是至關(guān)重要的，因此也可為抗HIV-1藥物的研發(fā)提供新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　一、研究對(duì)象
　　靜息CD4 T細(xì)胞:從正常人外周血中提取PBMC，并分選目的細(xì)胞。靜息CD4T細(xì)胞，使用抗體CD14、CD56、HLA-DR、CD8、CD11b/Mac-1、CD19進(jìn)行負(fù)選;靜息記憶CD4 T細(xì)胞，使

8、用抗體CD14、CD56、HLA-DR、CD8、CD11b/Mac-1、CD19、CD45RA進(jìn)行負(fù)選。參與本課題研究的所有志愿者均簽署了知情同意書(shū)，并通過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬└腥拘钥寺〉闹苽?br>　　質(zhì)粒提取:按質(zhì)粒大提試劑說(shuō)明書(shū)提取NL43及AD8質(zhì)粒，保存于-20℃。轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞鋪至100cm2培養(yǎng)皿中（3*106/皿）;12～24小時(shí)后，細(xì)胞80％～

9、90％融合可進(jìn)行轉(zhuǎn)染;將20ug質(zhì)粒DNA(NL43或AD8)和60ul LP2000混合至DMEM培養(yǎng)基中，加至前一天鋪好的293T細(xì)胞中，6小時(shí)后換D10培養(yǎng)基，37℃/5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)后收獲上清，即制備好的感染性克隆，于-135℃冰箱保存。
　?。ǘ㏄BMC中分選靜息CD4 T/Memory CD4 T細(xì)胞
　　正常人PBMC提取后，使用Dynabeads及相應(yīng)抗體(CD14、CD56、HLA-DR、CD8、C

10、D11b/Mac-1、CD19、CD45RA)通過(guò)陰性選擇方法分選出Reating CD4 T/Resting Memory CD4 T細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以R10培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1*106/ml，置于T25培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜培養(yǎng)，第二天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　（三）藥物處理后的細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)
　　將前一天分選好的靜息（記憶）CD4 T細(xì)胞以1*106/ml濃度分裝至流式管中，藥物(AZT、R10015、CK548等)處

11、理1小時(shí)（培養(yǎng)箱）后，加入感染性克隆(NL43或AD8)，2小時(shí)（培養(yǎng)箱）后R10洗去病毒及藥物（離心350g，5min），每管補(bǔ)R10至1ml，每天加入1ul IL-7(10ng/ul)，37℃/5％CO2培養(yǎng)。
　　結(jié)果：
　　一、 CCR5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HIV-1感染過(guò)程中的作用
　　1、為明確HIV-1感染靜息記憶CD4 T細(xì)胞的過(guò)程，是否受到HIV-CCR5信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，首先使用PTX對(duì)CCR5通路進(jìn)行阻斷

12、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTX處理過(guò)的細(xì)胞中，病毒復(fù)制受到抑制。
　　2、進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HIV-CCR5信號(hào)能夠誘導(dǎo)靜息記憶CD4 T細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。利用Jas對(duì)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行固定后，發(fā)現(xiàn)HIV復(fù)制也受到抑制，提示靜息記憶CD4 T細(xì)胞中病毒復(fù)制受到肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。
　　3、為進(jìn)一步明確HIV-CCR5信號(hào)是通過(guò)下游哪條通路對(duì)HIV感染進(jìn)行調(diào)節(jié)，我們又使用了LIMK抑制劑R10015和Arp

13、2/3抑制劑CK548分別對(duì)兩條通路進(jìn)行抑制，同樣發(fā)現(xiàn)HIV復(fù)制受到抑制，進(jìn)而我們得出結(jié)論:HIV-CCR5信號(hào)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)下游“LIMK-Cofilin”和“WAVE2-Arp2/3”兩條通路來(lái)影響病毒在靜息記憶CD4 T細(xì)胞中的復(fù)制。
　　二、細(xì)胞表面CD2分子在HIV-1感染過(guò)程中的作用
　　1、為明確HIV感染靜息CD4T細(xì)胞的過(guò)程是否受到來(lái)自CD2信號(hào)的調(diào)節(jié)，我們首先使用CD2抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD2抗體

14、幾乎能夠完全抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，且CD2的配體CD58對(duì)病毒的復(fù)制也有類似的抑制作用。
　　2、進(jìn)一步明確CD2對(duì)病毒感染的抑制作用是否是由細(xì)胞表面輔助受體表達(dá)下降所引起，我們發(fā)現(xiàn)CD2抗體處理過(guò)的細(xì)胞，表面CD4和CXCR4受體表達(dá)均有下降，且HIV進(jìn)入細(xì)胞的能力有所下降;此外CD2抗體處理過(guò)的細(xì)胞中，HIV DNA合成明顯下降。
　　3、我們還發(fā)現(xiàn)CD2抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白有明顯的極化作用，且能夠使細(xì)胞內(nèi)eofili

15、n進(jìn)一步失活。由此我們得出結(jié)論:CD2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面CD4和CXCR4受體表達(dá)，抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞;并通過(guò)改變actin的極化狀態(tài)，影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
　　結(jié)論：
　　1、HIV-1通過(guò)結(jié)合輔助受體CCR5，激活下游“LIMK-Cofilin”和“WAVE2-Arp2/3”兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來(lái)調(diào)節(jié)病毒感染。
　　2、CD2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)靜息CD4 T細(xì)胞表面CD4/CXCR4受體表達(dá)以及通過(guò)改變actin的極