深海鏈霉菌Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66中隱性次級代謝產物合成基因簇的激活及其產物發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、海洋鏈霉菌是發(fā)現新型藥物先導物的重要源泉，然而研究表明其中許多隱性(cryptic)次級代謝生物合成基因簇在實驗室條件下不表達或者表達量極低，從而極大阻礙了活性化合物的發(fā)現。本論文以深海鏈霉菌Streptomycessomaliensis SCSIO ZH66為研究對象，采用核糖體工程手段激活了其中編碼抗癌先導化合物FredericamycinA(FDMA)的隱性基因簇，進一步通過發(fā)酵工程策略顯著提高了FDMA的產量，主要研究結果如下:

2、
　　通過核糖體工程手段獲得具有利福平抗性菌株7株，鏈霉素抗性菌株4株，從突變株中篩選得到了一株能夠抗利福平達到300μg/mL，在MS平板上培養(yǎng)積累棕色色素的突變株RIF1，其他抗性突變株和野生菌株并不積累;該色素化合物粗提取物具有良好的抗癌活性。通過篩選合適的發(fā)酵培養(yǎng)基，最終分離純化得到該化合物純品;通過分析比對1H-NMR、13C-NMR等數據，確定其為FDMA，表明在突變株RIF1中隱性FDM A合成基因簇被激活。

3、　　進一步，本論文對突變株RIF1的rpoB基因序列進行分析，結果表明rpoB基因編碼的RNA聚合酶β亞基蛋白的第444位的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸。同時，對FDMA生物合成相關基因fdmD和fdmR1的表達情況進行了分析;半定量RT-PCR結果表明在MS平板上培養(yǎng)3d時，在野生株和突變株中均為檢測到二者的表達，培養(yǎng)5d和7d后，二者在野生株中未見表達，而在突變株RIF1中均被激活;進一步用熒光實時定量PCR(real time RT-PCR

4、)檢測了dmD和fdmR1基因的轉錄水平，結果證明了與野生株相比，突變株RIF1中dmD基因和fdmR1基因均被激活，培養(yǎng)7d時突變株體內fdmD基因和fdmR1基因轉錄水平比野生型菌株均提高了約15倍。
　　為了有效提高FDMA產量，通過單因素、PBD設計和響應面分析法BBD設計等手段對突變株RIF1產FDMA的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的FDMA產量比原始條件下的產量提高了3倍，達到679.5mg/L。與已報導

5、的菌株相比，突變株RIF1的發(fā)酵周期較短和培養(yǎng)成本低廉，是一株良好的潛在FDMA生產菌株。
　　綜上所述，本研究利用核糖體工程手段對深海鏈霉菌S.somaliensis SCSIOZH66進行抗性突變株的選育，從抗性穩(wěn)定的突變株中篩選得到隱性基因簇被激活，能夠產生抗癌活性化合物FDMA的突變株。進一步結合發(fā)酵工程手段對FDMA發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，使其產量得到明顯提高。該核糖體工程及發(fā)酵工程相結合策略為在基因組信息指導下激活和提高隱