低劑量輻射與RNA干擾對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1相關因子骨唾液酸蛋白(BSP)影響的初步研究.pdf

1、目的：骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是存在于細胞外基質中的一種主要由成骨細胞、破骨細胞及肥大軟骨細胞合成的高度磷酸化和糖基化的分泌性非膠原蛋白，BSP作為一種新的成骨細胞誘導劑，在成骨細胞增殖和分化過程中起到非常重要的作用。本文旨在通過低劑量輻射與RNA干擾技術以改變MC3T3-E1小鼠成骨樣細胞BSP的表達水平，以判定BSP表達變化對細胞包括對相關基因表達的影響，從而對BSP基因在成骨增殖和分化過程中的相關

2、功能進行初步研究。
　　 方法：1．對MC3T3-E1細胞進行0Gy、0.1Gy、0.5Gy,1.0Gy低劑量輻射：24h后進行MTT測吸光值，觀察細胞在5天內的增殖情況差異；24h后，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡差異；24h后換液培養(yǎng)至14d，RT-PCR檢測4d、7d、10d、14d時cbfal、BSP和OCN的表達差異。
　　 2．設計四條可能的小干擾RNA(siRNA)，分別將這四段siRNA插入到RNA干擾載體

3、pGPU6/GFP/Neo中構建成四條干擾載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP-1，2，3，4。采用陽離子脂質體包裹質粒轉染的方法，設計梯度轉染體系，以最高轉染效率和最低死亡率為原則，優(yōu)化表達載體轉染MC3T3-E1細胞的條件。
　　 3．按最優(yōu)轉染體系通過脂質體介導四條載體轉染到MC3T3-E1細胞，轉染后48小時抽提RNA，RT-PCR鑒定BSP基因在轉錄水平的改變；篩選出其中一條對BSP抑制作用最佳的載體。利用已構建

4、并篩選出的載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP轉染MC3T3-E1細胞，轉染后48小時抽提總RNA，RT-PCR鑒定BSP基因在轉錄水平的改變，同時利用RT-PCR鑒定cbfal、BSP和OCN mRNA的改變。
　　 結果：1．與空白對照組比較，第2d后，0.1Gy、0.5Gy的輻射對MC3T3-E1細胞增殖能力沒有明顯影響(P>0.05)，而1.0Gy輻射對MC3T3細胞增殖能力有顯著的促進作用(P<0.05)；與空白

5、對照組比較，1.0Gy可以明顯促進細胞進入G2/M期，促進細胞增殖，同時可以明顯抑制細胞凋亡；與空白對照組比較，0.1Gy，0.5Gy及1.0Gy的輻射均能上調cbfal、BSP和OCN mRNA的表達趨勢，且隨輻射劑量的增加而增強，其中1.0Gy組的表達顯著高于空白對照組(P<0.05)。
　　 2．成功構建四條BSP干擾表達載體。分別對4種轉染體系轉染效率進行比較，綜合最高轉染效率與最低細胞死亡率的優(yōu)化原則，最終選擇0.8u

6、g質粒/2ul脂質體的轉染比例。
　　 3．成功篩選出一條對BSP基因抑制效率較高的siRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP-l。RT-PCR結果顯示：轉染了有效干擾載體pGPU6/GFP/Neo-siBSP-l的細胞，BSP基因表達下調，cbfal和OCN mRNA表達量明顯下調。
　　 結論：1．低劑量輻射劑量1.0Gy可明顯上調BSP表達，同時促進MC3T3-E1細胞增殖，抑制細胞凋亡，上調cbfa

7、l和OCN mRNA的表達，為研究BSP與其它相關基因之間的關系提供了可能，同時上調BSP表達有利于骨損傷疾病的研究。
　　 2．成功構建四條BSP干擾表達載體。在最優(yōu)轉染條件下，采用瞬時轉染方法，成功篩選出一條有效的BSP基因的siRNA載體，繼而可以轉染MC3T3-E1細胞，并抑制cbfal和OCN等成骨相關基因的表達，為研究BSP在成骨細胞增殖和分化過程中的作用提供了技術支持，為進一步研究siRNA干擾BSP表達在臨床上的