寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶復(fù)合物的原核表達(dá)及活性研究.pdf

1、目的:本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組蛋白的原核表達(dá)體系并建立重組蛋白的純化工藝，表達(dá)寨卡病毒(ZIKV)的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2B的膜結(jié)合區(qū)域(NS2BH)和NS3具有蛋白酶活性的區(qū)域(NS3pro)，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，并檢測(cè)其酶活性，為進(jìn)一步研究NS2B-NS3蛋白酶復(fù)合物抑制劑打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用重疊PCR技術(shù)合成NS2BH和NS3pro基因序列，并引入Gly4-Thr-Gly4(G4TG4)氨基酸連接

2、臂的序列，最終構(gòu)建出NS2BH-G4TG4-NS3pro靶序列;
　　2.用原核表達(dá)載體pET-28b(+)和靶序列構(gòu)建目的蛋白表達(dá)載體pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，獲得高拷貝的重組質(zhì)粒。提取重組質(zhì)粒的DNA，并對(duì)其進(jìn)行序列分析。將經(jīng)過DNA序列分析的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21，采用菌落PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定。用IPTG誘導(dǎo)菌落PCR陽性的重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白。運(yùn)用鎳柱親和層析

3、技術(shù)純化表達(dá)的重組蛋白;
　　3.使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)，對(duì)重組蛋白酶復(fù)合物NS2BH-G4TG4-NS3pro進(jìn)行鑒定;
　　4.采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)分析蛋白酶復(fù)合物NS2BH-G4TG4-NS3pro的活性。
　　結(jié)果:
　　1.成功的利用重疊PCR技術(shù)合成了NS2BH-G4TG4-NS3pro靶序列。構(gòu)建出了pET-28b-NS2BH-G4TG

4、4-NS3pro原核表達(dá)載體。測(cè)序的結(jié)果顯示，目的序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中的ZIKV標(biāo)準(zhǔn)毒株(MR766，GenBank NO.NC_012532)的參考序列完全相同;
　　2.重組工程菌經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了NS2BH-G4TG4-NS3pro可溶性表達(dá)。重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析技術(shù)純化后，最終獲得了預(yù)期分子量且高純度的可溶性蛋白;
　　3.MALDI-TOF MS的結(jié)果證明，本研究誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為NS2BH-G4T