超聲微泡靶向介導(dǎo)microRNA-21調(diào)控PDCD4-NF-κB-TNF-α通路防治冠狀動(dòng)脈微栓塞致心肌損傷機(jī)制的研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈微栓塞（Coronary Microembolization，CME）是急性冠脈綜合征（Acute Coronary Syndrome，ACS）和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PercutaneousCoronary Intervention，PCI)治療過程中由于粥樣硬化斑塊碎屑的脫落引起的遠(yuǎn)端微血管栓塞的棘手并發(fā)癥，是患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良和主要心臟不良事件發(fā)生的強(qiáng)烈預(yù)測(cè)因子。目前研究表明CME致心功能損傷的機(jī)制主要與心肌局部炎癥有關(guān)，尤其與

2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)密切相關(guān)，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。
　　程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，不僅對(duì)細(xì)胞的程序性死亡進(jìn)行重要調(diào)節(jié)，而且對(duì)于炎癥發(fā)生也有重要作用，Sheedy等報(bào)道PDCD4可以促進(jìn)核因子-κB(nuclearfacotr-κappa B，NF-κB)活化，同時(shí)抑制IL-10的上調(diào)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定性心絞

3、痛患者PCI術(shù)后PDCD4表達(dá)明顯增加，促使TNF-α分泌增多，介導(dǎo)了PCI術(shù)后心肌的炎癥反應(yīng)。由于CME是PCI治療過程中常見的并發(fā)癥，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)CME后豬心肌細(xì)胞PDCD4表達(dá)水平明顯升高。因此，PDCD4介導(dǎo)的信號(hào)通路很有可能參與了CME后心肌炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長約21～25個(gè)核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物、病毒和單個(gè)細(xì)胞生物體中。miRNA存在

4、于基因組的非編碼區(qū)，是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化、凋亡、炎癥等過程的功能。
　　超聲靶向微泡破裂(ultrasound-targetedmicrobubble destruction，UTMD)是近年來新起的一種高效、安全、具有靶向性的非病毒基因傳輸技術(shù)，可以使目的基因更容易進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)并增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率。因此，本研究擬經(jīng)導(dǎo)管建立CME豬的動(dòng)物模型，構(gòu)建microRNA-21真核表達(dá)質(zhì)粒，通過

5、超聲微泡靶向介導(dǎo)轉(zhuǎn)染microRNA-21，檢測(cè)CME后PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況，以深入闡明microRNA-21防治CME致心肌損傷的效應(yīng)機(jī)制。
　　第一部分 冠狀動(dòng)脈微栓塞致心肌損傷過程中PDCD4的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化
　　目的:本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^建立豬的冠狀動(dòng)脈微栓塞(coronarymicroembolization，CME)模型，觀察CME致心功能損傷與程序性細(xì)胞死亡因子4（program

6、med cell death4，PDCD4）表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及關(guān)系。
　　方法:60頭巴馬小豬分為微栓塞組（CME組）、假手術(shù)組（Sham組），每組小豬均為30只;經(jīng)微導(dǎo)管左前降支注入微栓塞球構(gòu)建CME模型組，注射生理鹽水構(gòu)建假手術(shù)組。每組小豬按不同觀察時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為0h、3h、6h、9h、12h、24h組（每組小豬均為5頭）。應(yīng)用心臟超聲檢測(cè)心功能指標(biāo);電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)血清肌鈣蛋白(cTnⅠ)水平;組織病理切片蘇木素-伊

7、紅（HE）染色和蘇木素堿性復(fù)紅苦味酸(HBFP)染色進(jìn)行梗死區(qū)域測(cè)量;熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織PDCD4與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA表達(dá);Western blotting檢測(cè)心肌組織PDCD4與TNF-α蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:超聲心動(dòng)圖參數(shù)顯示，CME組除0h時(shí)間點(diǎn)外其余時(shí)間點(diǎn)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）均較Sham組明顯降低(P＜0.05)，伴隨著LVEF顯著下降，心臟超聲表現(xiàn)為左室短軸縮短率(FS)和心排血量(CO)

8、下降及左室舒張期末徑(LVEDd)增加。血清心肌損傷標(biāo)志物cTnⅠ在CME后3h開始升高，9h達(dá)到高峰，24h開始下降，但仍高于基礎(chǔ)值(P＜0.05)。病理學(xué)顯示，CME組3h、6h、9h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)均可見微梗死灶，但各時(shí)間點(diǎn)之間的微梗死面積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，CME組心肌組織PDCD4與TNF-α mRNA表達(dá)都是在3h開始升高，9h達(dá)高峰，12h和24h下降(P＜0.05)，
　

9、　結(jié)論:PDCD4參與了CME致心功能的損傷，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間變化規(guī)律，可能是通過調(diào)控心肌TNF-α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　第二部分 PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在豬冠狀動(dòng)脈微栓塞致心肌損傷中作用機(jī)制的研究
　　目的:冠狀動(dòng)脈微栓塞(coronary microembolization，CME)是冠狀動(dòng)脈血栓性病變行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PC

10、I)過程中常見的并發(fā)癥，CME所致的心肌局部炎癥反應(yīng)是引起進(jìn)行性心功能障礙的主要原因，程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)/核因子-κB（nuclear facotr-κappa B，NF-κB）信號(hào)通路在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但其在CME中的作用尚不清楚，因此本研究探討PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)通路對(duì)小豬CME致心肌炎癥反應(yīng)及心肌損傷的影響。
　　方法:20頭巴馬

11、小豬隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、微栓塞組(CME組)、CME+siRNA-PDCD4組、CME+siRNA-Control組，每組小豬均為5只。經(jīng)微導(dǎo)管左前降支注入微栓塞球構(gòu)建CME模型組，注射等量生理鹽水構(gòu)建Sham組。CME+siRNA-PDCD4組于CME前72h經(jīng)微導(dǎo)管在左前降支注入PDCD4 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物。CME+siRNA-Control組于CME前72h經(jīng)微導(dǎo)管在左前降支注入等量Control siRNA混合液

12、。應(yīng)用心臟超聲檢測(cè)心功能指標(biāo);電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)血清肌鈣蛋白(cTnⅠ)水平;組織病理切片HE及HBFP染色進(jìn)行梗死區(qū)域測(cè)量;熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織PDCD4與腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達(dá);Western blotting檢測(cè)心肌組織PDCD4與TNF-α蛋白表達(dá);應(yīng)用凝膠電泳遷移率轉(zhuǎn)變分析(EMSA)評(píng)價(jià)NF-κB活性。
　　結(jié)果:(1)超聲心動(dòng)圖參數(shù)顯示，與Sham組比較，CME組心功能顯著降低，表現(xiàn)為

13、心肌收縮功能障礙和左室擴(kuò)張即左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、心排血量(CO)下降(P＜0.05)以及左室舒張期末徑(LVEDd)增加(P＜0.05);與CME組比較，CME+siRNA-PDCD4組可改善CME導(dǎo)致的心功能損傷，下降血清cTnⅠ水平，表現(xiàn)為LVEF、FS、CO升高(P＜0.05)以及LVEDd減小(P＜0.05)。(2)與Sham組比較，CME組PDCD4與TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量以及NF-κB

14、活性均顯著增加(均P＜0.05);與CME組比較，CME+siRNA-PDCD4組中PDCD4與TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量以及NF-κB活性明顯較低（均P＜0.05）。
　　結(jié)論:PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活是CME致心肌損傷的重要機(jī)制，提示抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為CME防治的潛在新靶點(diǎn)。
　　第三部分 超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21調(diào)控PDCD4/NF-

15、κB/TNF-α通路防治冠狀動(dòng)脈微栓塞致心肌損傷
　　目的:冠狀動(dòng)脈微栓塞(coronary microembolization，CME)后導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是引起心肌損傷的主要原因，PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CME致心肌炎癥反應(yīng)中起到重要的作用，microRNA-21對(duì)心肌有保護(hù)作用，主要是通過調(diào)控其靶基因PDCD4實(shí)現(xiàn)，因此本研究探討超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21對(duì)CME小豬心功能的影響及其可能機(jī)制。

16、
　　方法:20頭巴馬小豬隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、微栓塞組(CME組)、CME+超聲介導(dǎo)基因組、CME+單純基因組，每組小豬均為5只。經(jīng)微導(dǎo)管左前降支注入微栓塞球構(gòu)建CME模型組，注射等量生理鹽水構(gòu)建Sham組。CME+超聲介導(dǎo)基因組于CME前4d經(jīng)耳緣靜脈注入質(zhì)粒-微泡混合液，同時(shí)予超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀經(jīng)豬胸壁輻照心肌。CME+單純基因組于CME前4d經(jīng)耳緣靜脈注入質(zhì)粒-微泡混合液，不予超聲輻照。應(yīng)用心臟超聲檢測(cè)心功能指標(biāo)

17、;電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)血清肌鈣蛋白(cTnⅠ)水平;組織病理切片HE及HBFP染色進(jìn)行梗死區(qū)域測(cè)量;冰凍切片熒光顯微鏡評(píng)估綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記基因表達(dá)量;熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織PDCD4與腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達(dá);Western blotting檢測(cè)心肌組織PDCD4與TNF-α蛋白表達(dá);應(yīng)用凝膠電泳遷移率轉(zhuǎn)變分析(EMSA)評(píng)價(jià)NF-κB活性。
　　結(jié)果:(1)與單純基因組相比，超聲介導(dǎo)基因組可使

18、心肌內(nèi)外源基因表達(dá)水平提高8倍以上(P＜0.05)。(2)超聲心動(dòng)圖參數(shù)顯示，與Sham組比較，CME組心功能顯著降低，表現(xiàn)為心肌收縮功能障礙和左室擴(kuò)張即左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、心排血量(CO)下降(P＜0.05)以及左室舒張期末徑(LVEDd)增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21可以有效的改善CME致心肌損傷，其主要機(jī)制是通過抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信號(hào)