中華卵索線蟲(chóng)tra-1基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、中華卵索線蟲(chóng)(Ovomermis sinensis)是一種昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，其性別分化決定于寄生期的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力(環(huán)境決定型)，目前有關(guān)此類線蟲(chóng)性別決定及分化的分子機(jī)制還不清楚。 為了探明中華卵索線蟲(chóng)性別決定及分化的機(jī)制，在參考國(guó)內(nèi)外其它線蟲(chóng)等相關(guān)研究文獻(xiàn)資料基礎(chǔ)上，首次從該線蟲(chóng)中克隆到了性別決定基因tra-1 cDNA片段，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其在中華卵索線蟲(chóng)發(fā)育各期中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。 主要的研究結(jié)果如下：

2、 (1)利用RT-PCR和3'RACE技術(shù)從中華卵索線蟲(chóng)中克隆了tra-1 基因3’端cDNA部分序列。該序列總長(zhǎng)度為800bp，編碼一個(gè)包含195個(gè)氨基酸殘基的多肽，用SMART軟件對(duì)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該多肽含有3個(gè)連續(xù)的C2H2型鋅指；同源性分析表明，本實(shí)驗(yàn)所獲得的中華卵索線蟲(chóng)tra-1基因氨基酸序列與人的GL13、果蠅CiD結(jié)構(gòu)域、C.elegans TRA-1A、C.briggase TRA-1A及Ppa-T

3、RA-1在鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域具有較高的同源性，相似性分別為：70％、71％、73％、77％、71％，而在此區(qū)域外相似性僅為6％。從而說(shuō)明中華卵索線蟲(chóng)tra-1基因編碼的蛋白質(zhì)亦屬于GLI轉(zhuǎn)錄因子家族，且僅在鋅指區(qū)域具有很高的保守性。 (2)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了tra-1基因在中華卵索線蟲(chóng)胚胎、感染期幼蟲(chóng)、A組(感染比例為1：40)寄生1、2、3、4、5、6天幼線蟲(chóng)、B組(感染比例為1：10)寄生1、2、3、4、5、6天幼線蟲(chóng)、

4、寄生后期雌幼線蟲(chóng)、寄生后期雄幼線蟲(chóng)、蛻皮后雌成蟲(chóng)、蛻皮后雄成蟲(chóng)和懷卵雌蟲(chóng)中的表達(dá)。結(jié)果顯示，蛻皮后雌成蟲(chóng)tra-1相對(duì)表達(dá)量最高，且與其它時(shí)期的差異極其顯著(P<0.01)；到懷卵雌蟲(chóng)與受精卵中tra-1相對(duì)表達(dá)量顯著下降，但仍顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；其它實(shí)驗(yàn)組包括感染期幼蟲(chóng)、寄生各期幼蟲(chóng)(寄生1、2、3、4、5、6天)、寄生后期雌雄蟲(chóng)及雄成蟲(chóng)之間表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)．結(jié)合形態(tài)學(xué)研究結(jié)果比較分析表明，在性腺分化的關(guān)

5、鍵時(shí)期，tra-1基因的高水平表達(dá)促使性腺分化為雌性生殖腺，低水平表達(dá)促使其分化為雄性生殖腺，即在中華卵索線蟲(chóng)，TRA-1A參與調(diào)控生殖腺的發(fā)育與分化；由定量結(jié)果，推測(cè)TRA-1A參與調(diào)控該線蟲(chóng)卵的形成和胚胎發(fā)育。 以上研究得出，IRA-1A在中華卵索線蟲(chóng)中的功能與其在其它自由生活的線蟲(chóng)中的功能是一致的，從而說(shuō)明TRA-1A在功能上具有一定的保守性。通過(guò)以上對(duì)中華卵索線蟲(chóng)tra-1 cDNA序列及表達(dá)模式研究表明，tra-1基因