小鼠間充質(zhì)祖細胞體外優(yōu)化培養(yǎng)及向神經(jīng)元樣細胞定向誘導分化的實驗研究.pdf

1、目的：對體外培養(yǎng)C57小鼠密質(zhì)骨來源的間充質(zhì)祖細胞（mesenchymal progenitor cells，MPC）的方法進行研究，建立適合小鼠MPC增殖的培養(yǎng)方案；探討小鼠密質(zhì)骨來源的MPC體外向神經(jīng)元樣細胞定向誘導分化的實驗研究。 方法： 取材方法選擇健康C57雌性小鼠，清潔級，3周齡，18±2g，取股骨、脛骨碎片經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白酶消化后作為MPC來源。 分組取得消化后的骨碎片，選取干細胞培養(yǎng)中經(jīng)常使用的DM

2、EM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基和TBD公司生產(chǎn)的胎牛血清（FCS）、GIBCO公司生產(chǎn)的胎牛血清，按不同搭配進行培養(yǎng)，隨機分為DMEM/F12+10％TBD胎牛血清組、DMEM/F12+10％GIBCO胎牛血清組、IMDM+10％TBD胎牛血清組、IMDM+10％GIBCO胎牛血清組、α-MEM+10％TBD胎牛血清組、α-MEM+10％GIBCO胎牛血清組，共6組，每組培養(yǎng)6份。 培養(yǎng)方法將小鼠密質(zhì)骨碎片

3、置入六孔板中，按不同分組加入相應培養(yǎng)液，放入37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后首次換液，以后每隔2-3 d換液一次。每天觀察細胞生長情況，當生長最好的實驗組原代（P0）細胞細胞貼壁超過培養(yǎng)板底面積80％時吸出培養(yǎng)液，用含0.04％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化、收集細胞，按固定細胞濃度傳入培養(yǎng)瓶。傳代后以后每2-3 d換液一次，當生長最好的實驗組細胞貼壁超過培養(yǎng)瓶底面積70％-80％時按固定細胞濃度1×103個/c㎡傳代。

4、 MPC純度鑒定采用流式細胞術分析，單標法檢測第三代（P3）MPC，取FITC標記的兔抗鼠CD29、CD31、CD44、CD90和PE標記的兔抗鼠CD45、CD106作為標記物，平行對照組為加入同型對照抗體的MPC?？紤]到實驗的需要以及研究生學習階段時間有限，只選擇采用優(yōu)化方案進行培養(yǎng)的MPC進行純度鑒定。 MPC的多向分化鑒定對MPC進行向骨細胞、脂肪細胞的定向誘導分化，驗證其具有干細胞的多向分化潛能，用茜素紅和油紅O

5、染色檢測誘導分化結果。同樣只選擇采用優(yōu)化方案進行培養(yǎng)的MPC進行多向分化能力鑒定。 MPC定向誘導成神經(jīng)元樣細胞的方法取優(yōu)化方案培養(yǎng)的P4代MPC，用微環(huán)境體液（神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液）進行誘導，取誘導24h后的MPC作為實驗標本。對其進行形態(tài)學觀察；免疫細胞化學檢測神經(jīng)元特異性標志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）及神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NF）的表

6、達情況，同時進行免疫熒光分析。 結果： C57小鼠間充質(zhì)祖細胞（MPC）體外優(yōu)化培養(yǎng) 原代培養(yǎng)Sd后，可見培養(yǎng)器皿底部有細胞貼壁生長，以圓形和扁圓形為主，10d后貼壁細胞逐漸鋪開，形成梭形或多角形，形態(tài)飽滿，折光性強，細胞間無重疊，有接觸抑制現(xiàn)象；傳代后細胞形態(tài)趨于一致，大部分為梭形，排列緊密，生長旺盛。當某個實驗組細胞貼壁超過底面積70％-80％時，對所有細胞進行傳代計數(shù)，觀察3代。結果發(fā)現(xiàn)在每一代的細胞計數(shù)

7、中，DMEM/F12+10％ GIBCO胎牛血清組的細胞數(shù)量都超過其他各組，通過統(tǒng)計學檢驗驗證DMEM/F12+10％ GIBCO胎牛血清組細胞數(shù)量與其余各組相比有顯著差異（P<0.05）。說明DMEM/F12+10％GIBCO胎牛血清更有利于MPC的體外培養(yǎng)增殖。 MPC純度鑒定 優(yōu)化方案培養(yǎng)的MPC表達間質(zhì)細胞標記CD29、CD44、CD90和CD106，不表達造血細胞標記CD31和CD45。說明得到的是同源性好、

8、純度高、排除了造血干細胞影響的MPC。 MPC多向分化能力鑒定 在用優(yōu)化方案培養(yǎng)的MPC定向誘導成骨細胞的實驗中，通過茜素紅染色發(fā)現(xiàn)誘導后細胞外基質(zhì)中大量鈣鹽沉積；在定向誘導成脂肪細胞的實驗中，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)細胞中出現(xiàn)的脂滴被染成點狀紅色，表明我們得到的MPC能向骨細胞、脂肪細胞分化。說明我們得到的是活性好、具有多向分化能力的MPC。 MPC體外向神經(jīng)元樣細胞定向誘導分化 經(jīng)誘導24h后，MPC細

9、胞形態(tài)發(fā)生變化，自胞體有突起長出，各細胞突起長短不一，類似神經(jīng)元。免疫細胞化學檢測結果表明，誘導后MPC的NSE（73.73％±9.88％）及NF（60.26％±7.19％）均陽性表達；免疫熒光檢測也證實免疫細胞化學檢測的結果。 結論: 1.實驗證明，用DMEM/F12+10％ GIBCO胎牛血清為培養(yǎng)液進行小鼠密質(zhì)骨來源的MPC體外培養(yǎng)最有利于其數(shù)量的擴增，得到的是同源性好、純度高、增殖活力強、具有多向分化潛能的MPC