鱗翅目昆蟲中piggyBac轉座子研究.pdf

1、piggyBac轉座子是典型的DNA轉座子，最初的序列在粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞系中分離(IFP2)。該轉座子目前已經開發(fā)成為轉基因昆蟲中應用最為廣泛的載體之一。雖然目前的研究工作已經表明，piggyBac廣泛分布于各類生物的基因組中，但由于發(fā)生移碼突變或者缺失而使絕大多數序列結構不完整，缺乏轉座活性。此外，與mariner等其他轉座子相比，piggyBac家族轉座子的生物學以及分子進化研究仍然比較滯后，這種現狀與

2、piggyBac類轉座子在轉基因昆蟲和基因分離、功能分析研究中的重要地位不相稱。因此，本文對鱗翅目昆蟲的13個科的41種昆蟲展開了piggyBac類轉座子分布的調查，對夜蛾中發(fā)現的轉座子進行全長基因克隆，并對克隆獲得的全長轉座子進行了活性測定和互作親和性分析，發(fā)現piggyBac轉座子末端和亞末端反向重復序列都是活性自主轉座子必需的元件。 1.鱗翅目昆蟲piggyBac轉座子的調查 采用簡并引物PCR和Southern點

3、雜交技術篩查了鱗翅目的13個科，41種昆蟲中piggyBac因子的分布情況。結果顯示，夜蛾科的五種昆蟲被檢測到內源性piggyBac因子的存在。這五種昆蟲分別是小地老虎(Agrotis ypsilon)，銀紋夜蛾(Argyrogramma agnata)，銀錠夜蛾(或稱為連紋夜蛾Macdunnoughia crassisigna)，斜紋夜蛾(Spodoptera litura)，瘦銀錠夜蛾(Macdunoughia confusa)。從

4、以上五種昆蟲基因組中克隆獲得的片斷長350bp～380bp，經Blast比對和序列分析，它們彼此之間以及與IFP2序列的相似性均在57％～97％不等。 2.piggyBac轉座子全序列的克隆 采用反向PCR和ITR PCR技術，從銀錠夜蛾，小地老虎和銀紋夜蛾三種昆蟲中成功克隆到相應的piggyBac轉座子全長，分別命名為 McrPLE，AyPLE和AaPLE。McrPLE全長2472bp，編碼595個氨基酸，與IFP2序列

5、高度相似，一致性達99.5％。AyPLE1.1和AaPLE1.1分別編碼完整的598和600個氨基酸的轉座酶，兩者之間的相似性為79％，它們與IFP2轉座酶的相似性分別為59％和62％，屬于IFP2中度相似序列。而AyPLE1.2和AaPLE1.2兩個轉座子序列均積累了較大的變異，不能編碼完整轉座酶蛋白。此外，AyPLE和AaPLE兩類因子含有完全一致的反向末端重復序列，但都不存在亞末端反向重復。 3.piggyBac轉座子基因

6、的系統進化分析 收集了14種生物的25個piggyBac類似因子的氨基酸序列，利用CLUSTALX1.8和MEGA3.1構建親緣關系樹，進行系統進化分析。結果顯示，進化樹中piggyBac轉座酶大致分為三大支，即CladeI，CladeII和CladeIII。這三大支中都既包含昆蟲又包括哺乳動物的piggyBac因子。本文所克隆的McrPLE，AyPLE1.1和AaPLE1.1都出現在CladeI中：McrPLE毗鄰IFP2；A

7、yPLE1.1，AaPLE1.1以及HaPLE1所在小分支與IFP2序列親緣關系最為接近，靴值高達100％。根據以上的進化分析結果以及轉座子序列結構特征推斷，AyPLE1.1，AaPLE1.1以及HaPLE1因子很可能是同一類新發(fā)現的piggyBac亞家族成員。此外，進化樹信息還顯示不但在不同生物中可含有高度相似的piggyBac因子，而且轉座子序列與宿主進化關系并不一致。以上結果揭示：piggyBac轉座子的進化不僅僅遵循垂直遺傳的規(guī)

8、律，而且存在著生殖隔離物種間的水平轉移機制。 4.三個piggyBac類似因子轉座活性分析 在果蠅S2細胞中建立起轉座子活性檢測系統，研究了piggyBac類似因子McrPLE，AaPLE1.1和AyPLE1.1的功能。結果表明，McrPLE不但能夠在細胞中精確的剪切，而且能夠準確地將KO α片段插入Target載體上的TTAA特異性位點。McrPLE因子的28個轉座事件分布于Target載體上可插入位點的85位

9、，101位，209位，363位，491位，603位，945位，992位和1863位，表現出插入位點的非特異性。AyPLE1.1的轉座酶不能識別缺少亞末端重復序列的pHa[KO α]Donor載體，但可以準確剪切和轉座另一個加入IFP2的亞末端反向重復的pHB[KO α]Donor載體。結果表明，AyPLE1.1轉座酶是一個有功能的蛋白，并且亞末端反向重復序列在轉座酶識別以及剪切反應中起著重要作用，一旦缺失就會嚴重影響轉座子的功能。AaP

10、LE1.1因子利用本研究采用的方法沒有檢測到活性檢，還有待進一步研究。 5.piggyBac因子相互作用初探 利用果蠅S2細胞轉化系統，研究了兩類活性因子IFP2，McrPLE和AyPLE1.1之間互相識別和作用的關系。結果顯示，兩類轉座酶表現出很強的專一性，均只能識別各自的反向末端重復序列。根據該研究結果推測，反向末端重復序列很可能是決定轉座酶識別和作用專一性的重要序列，而亞末端反向重復則似乎沒有種類的特異性。

11、在剪切實驗陰性對照中，偶然地發(fā)現pHB[KOα]Donor載體單獨轉染果蠅細胞48小時后能檢測到不精確地剪切活動，該結果暗示著果蠅S2細胞中的某個未知因子能夠與piggyBac轉座子載體互相作用，并有待進一步的實驗驗證分析，對piggyBac轉座子的轉基因安全性做出評估和鑒定。 綜上所述，本研究調查了鱗翅目中41種昆蟲內源性piggyBac轉座子的分布情況，分離到一個IFP2高度相似的自主活性因子McrPLE，和一個編碼活性轉座

12、酶的非自主因子AyPLE1.1。轉座子互作研究表明，piggyBac轉座子的末端和亞末端反向重復序列都是構成自主活性轉座子的必要元件，其中末端反向重復很可能決定著轉座酶識別和作用的專一性，而亞末端反向重復序列似乎沒有種類的特異性。 本文探索了在未知基因組生物中分離piggyBac轉座子的方法，為其他生物中克隆轉座子提供了可借鑒的手段；本研究深入了解了鱗翅目昆蟲內源piggyBac轉座子的分布，分子進化并探討了內源性piggyBa