長鏈非編碼RNA FOXD3-AS1在腦膠質(zhì)瘤中的表達及功能研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，在所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤中占的比例超過40％。盡管近年來針對膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療手段，包括外科手術(shù)切除、放療和化療均取得了巨大的進步，但是膠質(zhì)瘤患者的總體預(yù)后仍不甚理想。人們開始認識到膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多分子調(diào)控的復(fù)雜過程。越來越多具有促癌或抑癌作用的分子已經(jīng)被證明參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程，然而其確切的分子機制仍不清楚。因此，探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的特異性分子機制，為挑選能夠預(yù)測

2、膠質(zhì)瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物，并尋求新的治療策略成為了神經(jīng)外科研究的熱點。
　　長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸、并不能編碼蛋白質(zhì)的RNA。LncRNA起初被認為是轉(zhuǎn)錄噪音，但是越來越多的研究已經(jīng)證明lncRNA在包括癌癥在內(nèi)的人類疾病中起著重要的調(diào)控作用。所以，有理由推測lncRNA有可能成為腫瘤基因治療的一個新的靶點。與siRNA、miRNA等為代表的小RNA

3、不同，lncRNA能夠在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳學(xué)等多個水平調(diào)控下游基因的表達。近年來有研究報道，許多l(xiāng)ncRNA與它臨近的基因相互作用，組成“l(fā)ncRNA-mRNA”對的形式起作用。
　　前期的芯片數(shù)據(jù)結(jié)果表明，F(xiàn)OXD3-AS1在膠質(zhì)瘤中存在異常表達。但是，目前尚未有關(guān)于FOXD3-AS1方面的研究。
　　本實驗首先確定FOXD3-AS1在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達特點，通過統(tǒng)計學(xué)方法分析FOXD3-AS1表達水平與臨床病

4、例資料及患者預(yù)后之間的關(guān)系。然后通過一系列體外細胞功能實驗，進一步觀察FOXD3-AS1在膠質(zhì)瘤細胞系中的功能。再通過檢測其臨近基因FOXD3在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況，證明FOXD3-AS1與FOXD3的關(guān)系，并通過敲減膠質(zhì)瘤細胞系中FOXD3-AS1的表達量，觀察其中FOXD3的表達水平變化，初步探索FOXD3-AS1可能的作用機制。本實驗共分為四個部分:第一部分，長鏈非編碼RNA FOXD3-AS1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達研究;第二部分

5、，下調(diào)FOXD3-AS1的表達對膠質(zhì)瘤細胞系生物學(xué)特性影響的研究;第三部分，F(xiàn)OXD3-AS1靶基因的篩選及驗證其在人腦膠質(zhì)瘤中的表達研究;第四部分，F(xiàn)OXD3-AS1與FOXD3在人腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)性研究。
　　第一部分 長鏈非編碼RNA FOXD3-AS1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達研究
　　目的:初步研究FOXD3-AS1在腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達情況，結(jié)合臨床病例資料，分析FOXD3-AS1的表達量與患者各臨床指標(biāo)之

6、間的關(guān)系。
　　方法:在44例膠質(zhì)瘤組織及6例正常腦組織標(biāo)本中，采用q-PCR法檢測FOXD3-AS1在其中的表達情況，利用統(tǒng)計學(xué)方法分析FOXD3-AS1表達水平與患者各臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果:FOXD3-AS1在高級別膠質(zhì)瘤中的表達量顯著高于其在低級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。FOXD3-AS1在低級別膠質(zhì)瘤組織中的表達量與正常腦組織中表達量無明顯差異。臨床病例資料統(tǒng)計

7、分析結(jié)果顯示FOXD3-AS1的表達水平與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)(P=0.003)。Kaplan-Meier生存分析顯示FOXD3-AS1的表達水平與患者總生存時間呈負相關(guān)(P＜0.001);同樣在高級別膠質(zhì)瘤組織中，F(xiàn)OXD3-AS1的表達水平與患者總生存時間呈負相關(guān)(P＜0.05)。多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3-AS1的高表達是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素。
　　結(jié)論:FOXD3-AS1的表達隨著膠質(zhì)瘤級別的升高而升高，并

8、與患者的預(yù)后呈顯著負相關(guān)，F(xiàn)OXD3-AS1是膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的潛在致癌分子。
　　第二部分 下調(diào)FOXD3-AS1的表達對膠質(zhì)瘤細胞系生物學(xué)特性影響的研究
　　目的:初步研究FOXD3-AS1在膠質(zhì)瘤細胞系中的功能。
　　方法:設(shè)計合成FOXD3-AS1干擾序列，將其轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細胞系U251和A172中，采用real-time PCR檢測干擾效率。在FOXD3-AS1干擾序列轉(zhuǎn)染U251和A172膠質(zhì)瘤細胞系24小

9、時后采用一系列細胞功能實驗檢測FOXD3-AS1下調(diào)對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)特性的影響。
　　結(jié)果:將FOXD3-AS1干擾序列轉(zhuǎn)染U251和A172后，F(xiàn)OXD3-AS1表達量明顯下降。細胞增殖實驗（CCK-8）結(jié)果顯示，敲減FOXD3-AS1后，U251和A172細胞的增殖能力明顯下降;細胞周期實驗結(jié)果提示，敲減FOXD3-AS1后能夠引起U251和A172細胞發(fā)生S期阻滯，能夠引起細胞周期相關(guān)蛋白發(fā)生變化;敲減FOXD3-AS1能

10、夠明顯抑制U251和A172細胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)論:FOXD3-AS1在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著促進其增殖、遷移、侵襲的作用。
　　第三部分 FOXD3-AS1靶基因的篩選及驗證其在人腦膠質(zhì)瘤中的表達研究
　　目的:挑選FOXD3-AS1可能的靶基因，初步檢測其在膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達情況，結(jié)合臨床病例資料，分析其表達量與患者各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　方法:通過生物信息學(xué)分析尋找FOXD

11、3-AS1可能的靶基因，并在上述的44例膠質(zhì)瘤組織及6例正常腦組織標(biāo)本中，采用q-PCR、免疫組織化學(xué)技術(shù)和蛋白印跡法檢測其在標(biāo)本中的表達情況，利用統(tǒng)計學(xué)方法分析其表達水平與患者各臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果:FOXD3-AS1與FOXD3在基因序列中位置相關(guān)。FOXD3在高級別膠質(zhì)瘤中的表達量顯著高于其在低級別膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。FOXD3在低級別膠質(zhì)瘤組織中的表達量與正常腦組

12、織中表達量無明顯差異。臨床病例資料統(tǒng)計分析結(jié)果顯示FOXD3的表達量與膠質(zhì)瘤級別正相關(guān)(P=0.026)。Kaplan-Meier生存分析顯示FOXD3的表達水平與患者總生存時間呈負相關(guān)(P＜0.01)。
　　結(jié)論:FOXD3的表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別的升高而升高，并與患者的預(yù)后呈顯著負相關(guān)，F(xiàn)OXD3是膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的潛在致癌分子。
　　第四部分 FOXD3-AS1與FOXD3在人腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)性研究
　　目的:初

13、步研究FOXD3-AS1與FOXD3在膠質(zhì)瘤組織中表達量的相關(guān)性，探索FOXD3-AS1在膠質(zhì)瘤中起促癌作用可能的分子機制。
　　方法:采用皮爾森相關(guān)性分析法分析FOXD3-AS1和FOXD3在膠質(zhì)瘤組織中表達量的相關(guān)關(guān)系，在U251和A172細胞中敲減FOXD3-AS1后，觀察FOXD3蛋白水平是否發(fā)生變化。
　　結(jié)果:FOXD3-AS1與FOXD3在膠質(zhì)瘤組織中表達正相關(guān)，在U251和A172細胞中下調(diào)FOXD3-AS1