細胞程序性壞死在宿主防御病原體中的作用和調控機制研究.pdf

1、研究背景和意義:
　　病原體誘導的細胞死亡是哺乳動物防御系統(tǒng)的一個至關重要的部分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RIP3依賴的細胞程序性壞死參與到了機體防御外來入侵病原體的過程中，但病原體激活RIP3依賴的細胞程序性壞死的具體分子機制尚不清楚。
　　研究目的:
　　探究HSV-1誘導細胞程序性壞死的分子機制，以及這種程序性壞死方式如何在機體抗病毒中發(fā)揮作用。
　　研究方法:
　　為了篩選能夠引發(fā)RIP3-依賴性細胞壞死的病毒，我

2、們利用兩株牛痘病毒和兩株HSV-1感染W(wǎng)T和RIP3缺失的MEF細胞，檢測細胞的存活率；為了檢測了RIP3的缺失是否影響了病毒的入侵和復制，用HSV-1感染了野生型和RIP3缺失的MEF細胞，之后通過蛋白免疫印跡和熒光定量PCR檢測病毒蛋白和基因的表達水平。為了檢測RIP3缺失對NF-κB信號通路的影響，利用蛋白免疫印跡檢測MEF細胞和RIP3缺失的MEF細胞感染HSV-1后p-IκBα水平；為了檢測TNFR,TLR3，Nectin-1

3、，MLKL，CYLD和 DAI是否參與到這條信號通路，通過對TNFR1KO,TNFR1/2 DKO,TLR3 KO細胞感染HSV-1檢測存活率，通過RNAi沉默Nectin-1，CYLD后感染HSV-1檢測存活率，通過構建MLKL shRNA細胞系和通過CRISPR/Cas9技術構建DAI KO細胞系，感染HSV-1后檢測存活率；在RIP3缺失的MEF細胞上構建能穩(wěn)定表達HA和Flag標簽的RIP3的細胞系，對細胞感染病毒后，利用RIP

4、3的免疫共沉淀，將產(chǎn)物進行質譜分析去尋找參與激活HSV-1誘導的細胞壞死的關鍵作用蛋白；通過逆轉錄病毒體系使ICP6在細胞內過表達以檢測ICP6蛋白的表達是否足以激活RIP3/MLK依賴的細胞壞死；對野生型小鼠和和RIP3 KO小鼠腹腔注射HSV-1，檢測小鼠腦，脾，肝，血清中的病毒滴度，對小鼠肝臟進行切片及免疫組化，對小鼠注射一次或兩次病毒后，監(jiān)控存活率，以此確定RIP3在小鼠抵御病毒復制和致病中的作用。
　　研究結果:

5、　　（1）HSV-1的感染激活RIP3-依賴性細胞壞死；
　　（2）細胞凋亡不參與到HSV-1激活的細胞死亡:
　?。?）RIP3的缺失不影響HSV-1入侵細胞以及病毒自身的復制:
　?。?）RIP3的缺失不影響HSV-1激活的NF-κB信號活性:
　　（5）HSV-1感染誘發(fā)的細胞程序性壞死不依賴TNFR，CYLD，TLR3，但依賴于Nectin-1:
　?。?）HSV-1感染誘發(fā)的細胞程序性壞死不依賴于

6、DAI:
　?。?）MLKL是HSV-1感染誘發(fā)的細胞程序性壞死依賴于RIP3的底物MLKL:
　?。?）病毒蛋白ICP6參與到HSV-1激活的RIP3免疫復合體中；
　?。?）ICP6與RIP3通過RIP同源作用域(RHIM)相互作用；
　　（10）ICP6對于HSV-1誘導的細胞程序性壞死是必須的；
　?。?1）ICP6的表達足以激活RIP3/MLKL介導的細胞程序性壞死；
　?。?2）ICP6激

7、活的細胞程序性壞死依賴于ICP6和RIP3的RHIM結構域及RIP3的激酶活性；
　?。?3）RIP3介導的細胞程序性壞死幫助機體抵御HSV-1；
　?。?4）RIP3介導的細胞程序性壞死幫助宿主抵抗HSV-1的復制和造成的致死。
　　結論:
　　綜上所述，我們的工作首次發(fā)現(xiàn)了RIP3識別HSV-1病毒ICP6進而啟動宿主細胞程序性壞死的分子機制，并揭示了RIP3-依賴性細胞壞死在機體抗HSV-1病毒感染中的重要