基因組改組選育米曲霉α-淀粉酶高產菌株.pdf

1、基因組改組技術是建立在原生質體融合技術基礎之上的一種菌種選育技術。它通過多個親株的融合，使其全基因組進行隨機重組，獲得第一代融合株；再從中選擇獲得進一步提高的菌株作為下一輪融合的直接親本，依此類推進行多輪的多親株融合，最終從獲得的突變體庫中篩選出性狀提升的目的菌株。利用基因組改組技術可以在較短時間內獲得性狀優(yōu)良的重組體，同時剔除負突變，這在很大程度上彌補了傳統(tǒng)誘變法的不足。 淀粉酶做為工業(yè)生產中最為重要的酶之一，有各種不同的用途

2、。目前α-淀粉酶已經廣泛用于食品、發(fā)酵、谷物加工、紡織、造紙、醫(yī)藥等各個方面。在淀粉酶制劑工業(yè)化生產上，主要以微生物發(fā)酵生產為主，也可從植物和動物中提取。 本研究從土樣中篩選真菌α-淀粉酶，通過液體發(fā)酵選出高產菌株FS528做為出發(fā)菌株，通過形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，將分離得到的菌株命名為Aspe，gillus or，zae FS528，再利用基因組改組選育米曲霉高產α-淀粉酶的菌株。 一、真菌α-淀粉酶產生菌篩選與鑒

3、定 從土壤中篩選獲得一株高產α-淀粉酶真菌菌株FS528，產酶水平為2017.3U/mL。對該菌株進行形態(tài)學初步鑒定，為典型的曲霉屬菌種。提取FS528的18S rDNA，進行測序，并將測序結果與曲霉屬已知菌種18S rDNA序列進行比對，構建進化樹，最終確定該菌株為米曲霉(Aspe，gillus oryzae)。 二、米曲霉原生質體制備與再生 對米曲霉原生質體制備與再生條件進行了研究。實驗結果表明原生質制備的最

4、佳條件為：菌絲培養(yǎng)時間為14h，采用1％溶菌酶+0.5％蝸牛酶+1％纖維素酶的復合酶解液，選用0.6mol/L的NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑，在pH 5.0(磷酸鹽緩沖液)，30℃的條件下，酶解處理2.5h。采用PDA為基礎再生培養(yǎng)基，0.6mol/L的NaCl做為高滲穩(wěn)定劑，能夠使原生質體的再生率達到30％。 三、基因組改組選育米曲霉高產α-淀粉酶菌株 選用出發(fā)菌株Aspergillus oryzae FS528，FS179

5、，利用基因組改組技術選育米曲霉α-淀粉酶高產菌株。分別制備FS528，FS179原生質體，利用雙親滅活標記法，原生質體融合條件為：pH6.0、PEG30％、Ca2+0. 02mol/L、融合處理20min。采用透明圈法，從第一輪改組獲得的300個融合子中初篩獲得20個菌株，經過液體發(fā)酵復篩，選出產酶水平最高的兩株菌F1-3，F1-5進行第二輪基因組改組，從300個融合子中進行了初篩與復篩，獲得產菌水平最高的4個菌株F2-10，F2-14

6、，F2-15，F2-16。其中F2-14產酶水平達到4233.4U/mL，比出發(fā)菌株提高了52.34％。連續(xù)幾代培養(yǎng)與發(fā)酵結果表明該菌株具備較好的遺傳穩(wěn)定性。 四、改組前后菌株形態(tài)學觀察與RAPD分子鑒定 通過形態(tài)學觀察，發(fā)現改組后菌株在生長速度，產孢數量上與出發(fā)菌株相比，有了較大的改善；通過RAPD擴增檢測，親緣關系聚類分析結果表明：原始菌株與第一輪改組得到的兩個菌株親緣關系最近，與第二輪改組菌株的親緣關系較遠，而第二