KLF6基因表達下調(diào)在腎透明細胞癌遠處轉(zhuǎn)移中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性疾病之一，在所有的泌尿系統(tǒng)腫瘤中，腎癌的發(fā)生率和死亡率為第二位。腎透明細胞癌是腎細胞癌中最常見的病理類型，對放化療不敏感，臨床上缺乏有效的預(yù)測指標及治療靶點。前期芯片結(jié)果提示在轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌原發(fā)灶腫瘤組織中轉(zhuǎn)錄因子KLF6的表達下調(diào)，E2F1的表達升高。因此本課題探討了KLF6和E2F1在腎透明細胞癌遠處轉(zhuǎn)移中的作用和可能的作用機制。
　　方法:①將配對的4例原發(fā)轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌以及5例原

2、發(fā)未轉(zhuǎn)移腎透明細胞癌組織樣本，使用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 Array進行mRNA微陣列芯片篩選。t檢驗篩選分組間具有明顯表達差異的基因(P＜0.05)。隨后利用實時定量PCR和western blot在擴大的樣本量中檢測差異基因KLF6 mRNA表達水平和蛋白表達水平，驗證芯片結(jié)果。②腎癌細胞系（769-P，786-O，Caki-2，以及OS-RC-2）的體外實驗研究KLF6對細胞增殖、

3、侵襲、遷移等生物學(xué)功能的影響。③基于生物信息學(xué)Gene Set Enrichment Analysis(GESA)分析可能的促進腎透明細胞癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因。對關(guān)鍵因子E2F1啟動子區(qū)域的高級分析及預(yù)測，計算編碼基因集合與轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物的靶基因集合的交集，利用計算該交集的富集程度，得到與E2F1顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，尋找KLF6與E2F1表達調(diào)控相關(guān)的作用機制。④建立裸鼠腎臟原位和轉(zhuǎn)移腫瘤模型，利用分子顯像系統(tǒng)活體監(jiān)測K

4、LF6與E2F1對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響。⑤組織標本中檢測KLF6以及E2F1與臨床資料及隨訪結(jié)果的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:①在擴大的樣本量（轉(zhuǎn)移性VS非轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌）組織中檢測KLF6 mRNA和蛋白的表達。結(jié)果表明KLF6 mRNA和蛋白水平在原發(fā)性轉(zhuǎn)移組中下調(diào)，證實了芯片檢測的結(jié)果。②MTS以及細胞遷移和侵襲實驗結(jié)果表明KLF6能抑制腫瘤細胞的增殖，降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。③在腎透明細胞癌中，KLF6能夠通過結(jié)合E

5、2F1啟動子區(qū)域抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄，繼而下調(diào)E2F1的表達。④在腎癌細胞系中KLF6表達下調(diào)能促進E2F1基因的表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤細胞侵襲遷移。⑤裸鼠原位腎腫瘤和肺轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果表明，原位種植穩(wěn)定敲低KLF6的786-O細胞株與對照組相比，腫瘤體積明顯增大，肺部轉(zhuǎn)移灶的形成顯著增多，而敲低E2F1表達，能夠逆轉(zhuǎn)以上促進腫瘤進展的過程。⑥對114例腎透明細胞癌患者臨床數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)KLF6的mRNA表達下

6、調(diào)和腎腫瘤T分期是腎透明細胞癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。隨訪和生存分析結(jié)果表明腎癌組織KLF6低表達和E2F1高表達的患者預(yù)后不良。
　　結(jié)論:①轉(zhuǎn)錄因子KLF6表達下調(diào)可能與腎透明細胞癌的進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。②KLF6在腎透明細胞癌細胞系中抑制增殖，降低細胞侵襲力。③腎透明細胞癌中KLF6能負向調(diào)控E2F1并能通過影響EMT相關(guān)下游靶基因來促進腎透明細胞癌的惡性進展和遠處轉(zhuǎn)移。④KLF6低表達是腎透明細胞癌患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的獨立危