注射用丹參多酚酸對實驗性腦缺血小鼠神經(jīng)功能改善和神經(jīng)再生的影響及其作用機制的研究.pdf

1、目的:腦卒中不僅會造成急性期腦損傷，由于損傷腦組織恢復不佳，也會引起恢復期運動功能的損傷，造成極高的致殘率。由于rt-PA過窄的時間窗限制，在腦卒中發(fā)生后的24小時內(nèi)患者常常不能得到及時治療，因此開始于腦卒中發(fā)生24小時之后的延遲治療越來越受到人們的重視與關注。丹參作為一種中藥，已被各種研究證實具備神經(jīng)保護作用，并廣泛應用于缺血性腦卒中患者。注射用丹參多酚酸是從丹參中提取的復方成分，已有實驗證實其在腦卒中的急性期具有神經(jīng)保護作用，但對于

2、這種藥物對腦卒中延遲治療效果及其是否可改善腦卒中后神經(jīng)功能的恢復及可能的作用機制卻研究甚少。
　　成年哺乳動物腦內(nèi)存在兩個能產(chǎn)生大量神經(jīng)元的生發(fā)區(qū)，分別為側(cè)腦室的腦室下帶(subventricularzone，SVZ)和海馬的顆粒下帶(subgranularzone，SGZ)。在一些刺激如缺血性腦卒中的作用下，SVZ區(qū)神經(jīng)前體細胞能被激活而增殖并向缺血半暗帶遷移，分化成熟以取代梗死區(qū)受損的神經(jīng)元，以促進神經(jīng)功能恢復。Sonic h

3、edgehog(Shh)信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)和多種器官的正常形成和構建中起重要作用，近年來該信號因與神經(jīng)組織發(fā)生及神經(jīng)前體細胞的增殖、分化、遷移的密切關系而備受關注。
　　一些神經(jīng)生長因子可促進成年動物腦內(nèi)神經(jīng)再生，在缺血性腦卒中的恢復期與運動功能的恢復密切相關。Brain derived neurotrophic factor(BDNF)和Nerve Growth Facto(NGF)已證實在生理和病理條件下均與腦內(nèi)SVZ區(qū)神經(jīng)前

4、體細胞的增殖、分化及遷移緊密相關。但是，對于Shh信號通路與BDNF及NGF表達的關系仍知之甚少。
　　本實驗旨在研究注射用丹參多酚酸的延遲性治療可否促進缺血性腦卒中后恢復期神經(jīng)功能的恢復和神經(jīng)再生，且Shh信號通路是否為該藥物長時程應用的作用靶點。
　　方法:采用永久性結扎右側(cè)頸總動脈并在顯微鏡下燒灼右側(cè)大腦中動脈的皮層分支以制備C57BL/6小鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)。實驗動物隨機分為假手術組(Sham)，梗死組(

5、MCAO)，小劑量用藥組(Sals-L)，大劑量用藥組(Sals-H)，抑制劑組(CYC)，抑制劑+用藥組(CYC+Sals)。各組小鼠分別于造模后24小時開始腹腔給予不同劑量的藥物(15 mg/kg，30 mg/kg)或抑制劑（10 mg/kg），連續(xù)14天。分別于術后1、7、14、21、28天對各組小鼠進行Rotarod及mNSS神經(jīng)功能評分，于28天用HE染色法測定腦梗死體積，于術后7、14、28天用免疫熒光染色測定神經(jīng)再生相關指

6、標（包括神經(jīng)前體細胞的增殖、分化、遷移及少突膠質(zhì)前體細胞的增殖、分化等的相關指標），于術后3、7、14天用免疫印記(Western blot)、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定Shh信號通路上相關因子(Shh，Ptch，Gli1)及BDNF、NGF的蛋白及基因表達。
　　結果:
　　1、注射用丹參多酚酸改善了腦缺血小鼠的神經(jīng)功能
　　對梗死組、小劑量用藥組、大劑量用藥組、抑制劑組、抑制劑+用藥組組小鼠于術后1、

7、7、14、21、28天進行Rotarod和mNSS神經(jīng)功能評分。梗死后24小時，各組小鼠均顯示了神經(jīng)缺損癥狀，各組間神經(jīng)功能學評分未見明顯差異(P＞0.05)。與梗死組相比，大劑量用藥組的神經(jīng)功能評分在14天(Rotarod)及21天（mNSS）明顯改善，且持續(xù)到梗死后第28天，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與大劑量用藥組相比，抑制劑組、抑制劑+用藥組（劑量同大劑量用藥組）的神經(jīng)功能評分在14天(Rotarod)及21天(mNS

8、S)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但兩者與梗死組相比在任何時間點均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　2、注射用丹參多酚酸對腦梗死體積無影響
　　造模后第28天，Sham組腦組織未見梗死灶，用藥組梗死體積較梗死組相比未見明顯減(Sals vs.MCAO:11.39％±1.73％ vs.11.60％±2.07％，P＞0.05)。
　　3、注射用丹參多酚酸通過介導Shh信號通路促進腦缺血后神經(jīng)再生
　

9、　Confocal結果顯示，術后7、14、28天，用藥組（之后實驗中用藥組劑量同大劑量用藥組）同梗死組相比，梗死側(cè)dSVZ區(qū)BrdU+細胞數(shù)及dSVZ區(qū)、vSVZ區(qū)DCX密度顯著增多，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，梗死對側(cè)未見明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，抑制劑+用藥組同用藥組相比在梗死側(cè)上述指標均有顯著性下降(P＜0.05);DCX與BrdU共標表明梗死后神經(jīng)再生，且造模后7、14、28天用藥組DCX/BrdU共標細胞數(shù)占Brd

10、U陽性細胞百分比較梗死組相比在梗死側(cè)具有顯著性增加，同時應用抑制劑則可逆轉(zhuǎn)上述作用(P＜0.05)。
　　Confocal結果顯示，在梗死灶周邊的皮層和紋狀體也可觀察到DCX+細胞，說明神經(jīng)前體細胞在梗死后發(fā)生了由SVZ區(qū)至梗死區(qū)的遷移。在梗死區(qū)域周邊可以觀察到NeuN、GFAP、Iba1與BrdU的共標，說明在腦梗死發(fā)生后神經(jīng)前體細胞可以遷移至梗死區(qū)周邊并分化成熟以取代受損的神經(jīng)細胞。
　　通過對神經(jīng)前體細胞的熒光染色發(fā)現(xiàn)

11、SVZ區(qū)的神經(jīng)前體細胞具有很多分支，梗死后28天無論用藥組還是梗死組DCX/Tuj-1共標均占很大一部分，但用藥組DCX/MAP-2及DCX/SMI312共標數(shù)均較梗死組增多，說明藥物可以促進神經(jīng)前體細胞的突起向成熟的樹突及軸突分化。
　　此外我們還觀察了SVZ區(qū)及胼胝體區(qū)少突膠質(zhì)細胞的增殖及分化情況。結果表明，梗死后28天，在用藥組梗死側(cè)SVZ區(qū)NG2+細胞數(shù)較梗死組相比有增多，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，此差異并未出現(xiàn)在

12、梗死對側(cè)(P＞0.05)。無論在SVZ區(qū)還是梗死灶周邊的胼胝體區(qū)域均可以觀察到NG2/BrdU的共標。此外，梗死后28天，梗死灶周圍胼胝體區(qū)用藥組CNPase/BrdU共標細胞數(shù)占BrdU陽性細胞百分率較梗死組增加，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　4、注射用丹參多酚酸上調(diào)Shh、Ptch、Gli1的蛋白及基因表達，上調(diào)BDNF及NGF的表達
　　Confocal結果顯示DCX/Shh、NeuN/Shh、MAP-2/Sh

13、h、SMI312/Shh均有共標，且BDNF及NGF也均與DCX、Tuj-1、NeuN、MAP-2、SMI312共標。
　　Western blot，RT-qPCR檢測結果顯示:梗死后3、7、14天，梗死組小鼠缺血側(cè)腦皮層的Shh、Ptch、Gli1的水平上調(diào)，藥物干預后，其水平較梗死組相比增多，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，梗死對側(cè)皮層上述指標未見明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。BDNF、NGF在梗死后第3天并未在用藥組及梗

14、死組之間出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，而第7天及第14天，梗死側(cè)皮層在用藥組兩者的表達同梗死組相比均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，梗死對側(cè)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　Western blot結果顯示:梗死后14天，抑制劑+用藥組小鼠較用藥組小鼠相比，shh信號通路上的指標Ptch及Gli1在梗死側(cè)皮層的表達下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時BDNF和NGF的表達在梗死側(cè)皮層也下調(diào)，且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。但Shh