人源磷酸二酯酶6(PDE6)γ亞基蛋白的克隆、表達以及純化.pdf

1、環(huán)鳥苷酸和環(huán)腺苷酸是細胞內重要的第二信使且在信號轉導和轉換過程中都有著非常重要的調節(jié)功能。磷酸二酯酶（PDE）是環(huán)核苷酸信號轉導過程中的決定性環(huán)節(jié)而且對調節(jié)其細胞內水平具有關鍵性作用。 磷酸二酯酶6（PDE6）是以環(huán)鳥苷酸為特異性底物的磷酸二酯酶，在光感受器細胞的生化級聯反應過程中起了重要的作用，根據其存在的形式不同可分為視網膜桿狀細胞PDE6（Rod-PDE6）及視網膜錐狀細胞PDE6（Cone-PDE6），其中以視網膜桿狀

2、細胞為主。Rod-PDE6全酶是一個四聚體復合物，包括兩個大的催化亞基（α和β）和兩個小的抑制亞基（γ），其中γ亞基主要是通過結合α和β催化亞基的催化位點從而抑制全酶活性。為了研究人源rod-PDE6γ蛋白的結構和功能從而了解其在視覺信號傳導過程中的作用，我們研究了該目的蛋白的重組表達和分離純化的方法。 本文利用PCR技術體外擴增了PDE6γ的編碼基因，并通過NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點將其與表達載體pET-22b連接，從

3、而構建了其重組表達質粒pET22b-PDE6γ，然后將重組質粒轉入大腸桿菌（E.coli）感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，得到該蛋白的重組表達工程菌。分別采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、尿素變性凝膠電泳、基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）等方法對影響重組蛋白表達及純化的因素進行了研究，并對誘導表達溫度進行了優(yōu)化，確定該蛋白的最佳表達溫度為16℃。通過金屬離子螯合親和層析柱對該蛋白進