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文檔簡介
1、目的:
乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害著女性的生命和健康。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升,且發(fā)病年齡呈年輕化。乳腺癌是內(nèi)分泌依賴性腫瘤,雌激素會(huì)刺激乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展,并增加乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)率。相比于細(xì)胞毒性藥物治療,內(nèi)分泌治療具有其副作用小、方便服用、效應(yīng)持久,對(duì)患者生活質(zhì)量影響小等優(yōu)點(diǎn),成為乳腺癌最重要的治療手段之一。他莫昔芬(三苯氧胺,tamoxifen TAM)是一種選擇性雌激素受體調(diào)變劑,用于絕經(jīng)
2、前雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性的乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療。目前臨床上約40%~50% ER陽性的乳腺癌患者對(duì)抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥。但TAM耐藥機(jī)制尚不明確,ER的丟失和變異并不能完全解釋TAM抵抗。
本課題的前期研究發(fā)現(xiàn),抗雌激素藥物——他莫昔芬調(diào)節(jié)CerbB-2基因表達(dá),繼而調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞生長。在此過程中,有兩個(gè)基因:PAX2(配對(duì)盒基因,Paired box gene)及AIB-1(Ampl
3、ified in breast cancer1,又稱SRC-3)起到很重要的介導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)PAX-2與AIB-1競爭性結(jié)合ER受體以調(diào)控HER-2的轉(zhuǎn)錄,從而決定他莫昔芬對(duì)乳腺癌內(nèi)分泌治療的有效性。鑒于此,本文對(duì)PAX2和AIB1在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞生長及他莫昔芬耐藥中的作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。
方法:
1、PAX-2、AIB-1基因重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株的建立
1.1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)
4、染:將PAX-2、AIB-1基因的重組質(zhì)粒(EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1))大量提純。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選4-5周,分別得到穩(wěn)定高表達(dá)PAX-2、AIB-1基因的新乳腺癌細(xì)胞株(命名為MCF-7-PAX-2、MCF-7-AIB-1)。設(shè)立陰性質(zhì)粒[EX-NEG-M90(空載)]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞株為對(duì)照(命名為MCF-7-空載)。
5、通過綠色熒光蛋白GFP檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的驗(yàn)證:實(shí)驗(yàn)分組:未處理組(MCF-7細(xì)胞);空載組(MCF-7-空載);對(duì)照組1(MCF-7-AIB1);對(duì)照組2(MCF-7-PAX2)。采用RT-PCR、Western blot方法分別檢測四組細(xì)胞株P(guān)AX2mRNA、AIB1mRNA及PAX2、AIB1蛋白表達(dá)量,以驗(yàn)證獲得的細(xì)胞株為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力及耐藥性的研究<
6、br> 2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的建立和腫瘤體積的測量將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,于裸鼠于右側(cè)背部皮下注射細(xì)胞懸液,使接種細(xì)胞總數(shù)為1.5×107個(gè)/只。接種后觀察到腫瘤生長,按公式計(jì)算腫瘤體積(Tumor Volume) TV=1/2×LW2。待接種7周后給予他莫昔芬灌胃,觀察處理后腫瘤生長情況。
2.2裸鼠成瘤標(biāo)本檢測
接種12周后處死小鼠,取出皮下腫瘤,HE染色結(jié)果證實(shí)為接種瘤。同時(shí),提取裸鼠腫瘤組
7、織總RNA和總蛋白,進(jìn)行Western Blot和Real time PCR檢測PAX2、AIB1、HER2及增殖相關(guān)因子ki-67的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組化對(duì)PAX2、AIB1、HER-2、ki-67特異性表達(dá)情況進(jìn)行檢測。
3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
每組實(shí)驗(yàn)不少于3次獨(dú)立樣本的重復(fù),采用SPSS軟件(13.0)進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)和非參數(shù)檢驗(yàn),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,檢驗(yàn)
8、以P<0.05為差異有顯著性意義。
結(jié)果:
1、質(zhì)粒提純情況
?、偬峒兊腅X-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90(空載)質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,獲得約與目的大小一致的條帶。
?、谧贤夥止夤舛葍x法測定EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90(空載)質(zhì)粒濃度分別為684μg/ml,OD2
9、60/OD280值為1.956;598μg/ml,OD260/OD280值為1.942;962μg/ml,OD260/OD280值為1.959。質(zhì)粒提純成功,純度高,濃度高,可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
?、厶峒冑|(zhì)粒進(jìn)行檢測,質(zhì)粒所測部分堿基序列無錯(cuò)誤。
2、轉(zhuǎn)染效率
通過綠色熒光蛋白GFP檢測,MCF-7-PAX-2細(xì)胞、MCF-7-AIB-1細(xì)胞、MCF-7-空載細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%左右。
3、穩(wěn)轉(zhuǎn)株P(guān)A
10、X2、AIB1基因mRNA表達(dá)情況
RT-PCR結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2細(xì)胞PAX-2mRNA明顯升高,升高至321.08倍(P<0.05);AIB-1 mRNA無明顯變化。MCF-7-AIB-1細(xì)胞AIB-1 mRNA明顯升高,599.665倍(P<0.05); PAX-2mRNA無明顯變化。MCF-7-空載細(xì)胞PAX-2mRNA、AIB-1 mRNA均無明顯變化。
4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株P(guān)AX2、AI
11、B1蛋白表達(dá)情況
Western blot結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2細(xì)胞PAX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.677±0.346,明顯升高,升高了67.7%(P<0.05); AIB-1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.162±0.145,無明顯變化。MCF-7-AIB-1細(xì)胞AIB-1蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.446±1.207,明顯升高,升高了144.56%(P<0.05);PAX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.059±0.030,無明
12、顯變化。MCF-7-空載細(xì)胞PAX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.035±0.040,AIB-1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.172±0.258均無明顯變化(P>0.05)。
5、瘤體積測量結(jié)果:
?、俳臃N3周后四組小鼠均形成腫瘤。
?、诮臃N5周后,各組間瘤體積即出現(xiàn)明顯區(qū)別。與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤明顯小于未處理組,瘤體積小于7.36%(P<0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤明顯大于未處理組,瘤體積大
13、于13.09%(P<0.05);而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性(P>0.05)。
③接種7周后,與未處理組相比, MCF-7-PAX-2組腫瘤體積為876.76±48.11,明顯小于未處理組,瘤體積小于15.69%(P<0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤體積為1596.99±64.97,明顯大于未處理組,瘤體積大于53.57%(P<0.05);而MCF-7-空載組腫瘤體積為1101.99±93.3,與未處
14、理組相比差異無顯著性(P>0.05)。
?、芩舴夜辔?周后,與處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤生長速度明顯小于未處理組,27.5%(P<0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤生長速度明顯大于未處理組,125.75%(P<0.05);而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性(P>0.05)。
6、接種瘤HE和免疫組化結(jié)果:
?、貶E染色觀察實(shí)驗(yàn)組和未處理組細(xì)胞形成的皮下腫瘤組織惡性程度無明顯差
15、異,均可見高分裂像,瘤細(xì)胞排列密集形狀近于卵圓形或多邊形。
?、诿庖呓M化顯示,四組腫瘤PAX-2、AIB-1、HER-2、ki-67均為陽性。與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2強(qiáng)陽性表達(dá)率高(P<0.05),HER2強(qiáng)陽性表達(dá)率低(p<0.05),AIB-1、Ki-67均無顯著差異(P>0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1強(qiáng)陽性表達(dá)率高(p<0.05),HER2、PAX-2、ki-67均無顯著差
16、異(P>0.05);而MCF-7-空載細(xì)胞和未處理組相比差異無顯著性P>0.05)。
7、接種瘤RT-PCR結(jié)果顯示:與未處理組相比, MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2mRNA明顯升高,升高13315.24%(P<0.05),AIB-1mRNA、HER2mRNA顯著降低,分別降低67.16%、54.63%(P>0.05); MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1 mRNA、HER2mRNA明顯升高,分別升高5801.77
17、%、538.49%(P<0.05),PAX-2mRNA顯著降低,降低28.9%(P>0.05);MCF-7-空載組腫瘤PAX-2mRNA、AIB-1 mRNA、HER2mRNA和未處理組相比差異無顯著性(P>0.05)。
8、接種瘤Western blot結(jié)果顯示:與未處理組相比,MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2陽性表達(dá)率升高91.06%(P<0.05),AIB-1、HER2陽性表達(dá)率分別降低33.86%、38.65%(
18、P<0.05),Ki-67均無顯著差異(P>0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1、HER2陽性表達(dá)率分別升高256.71%、270.23%(P<0.05),PAX-2陽性表達(dá)率降低71.72%(P<0.05),Ki-67無顯著差異(P>0.05);MCF-7-空載腫瘤組PAX-2、AIB-1、HER2表達(dá)情況和未處理組相比差異無顯著性(P>0.05)。
結(jié)論:
1、AIB-1高表達(dá)可促進(jìn)ER陽性乳腺癌M
19、CF-7細(xì)胞在體內(nèi)的生長,PAX-2高表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞在體內(nèi)的生長。
2、AIB-1高表達(dá)可導(dǎo)致ER陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)于TAM的敏感性降低,PAX-2高表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞對(duì)于TAM的藥物敏感性。
3、AIB-1高表達(dá)可促進(jìn)HER-2的表達(dá),PAX-2高表達(dá)可抑制HER-2的表達(dá)。
4、AIB-1高表達(dá)或PAX-2高表達(dá)均不影響ki-67的表達(dá)。
5、PAX-2高表達(dá)及AIB-
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