應用CRISPR-Cas9技術敲除食管鱗癌EC109細胞系DMRT2基因及其生物學功能的初步探究.pdf

1、背景：
　　在我國，食管癌是高發(fā)的惡性腫瘤之一，病理學類型仍以鱗狀細胞癌為主。目前雖然在食管癌流行病學、早期診斷、綜合治療及預防等方面有了很大的進展，但是食管癌的死亡率仍然很高。惡性腫瘤的形成是一個多階段逐步發(fā)展的過程，與遺傳學突變和環(huán)境因素有關，在內(nèi)源性的突變基因和外源性促癌因素共同驅(qū)動下，很多腫瘤細胞逐漸進展為臨床上可見的病理學形態(tài)。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。通過我們前期研究，對10對食管鱗

2、癌及癌旁正常組織CDNA芯片的47000個轉(zhuǎn)錄子及變異型表達情況的比較分析[1]，發(fā)現(xiàn)數(shù)個差異性表達上調(diào)基因：DMRT2、CTTN、MCM10和SCYA26。其中DMRT2基因?qū)儆贒M基因（double-sexandmab-3relatatedtranscriptionfactor）家族，表達一類轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是調(diào)控性別的發(fā)育和分化。而有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌、乳腺癌及腎透明細胞癌中[2-4]，該基因表達缺失。為了推測DMRT2在

3、食管鱗癌中的生物學功能作用，本研究將基于食管鱗癌細胞水平，應用CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向敲除食管鱗癌細胞株中DMRT2基因，利用功能實驗探究DMRT2在食管鱗癌中的生物學作用。
　　目的：
　　本研究擬應用CRISPR/Cas9技術建立DMRT2敲除食管鱗癌細胞株，探討DMRT2在腫瘤細胞中的生物學功能。
　　研究方法：
　?。?）培養(yǎng)5株食管鱗癌細胞系；利用Westernblot篩選出DMRT2高表

4、達的細胞系；
　　（2）在DMRT2exon上設計sgRNA及reporter（包含sgRNA序列及熒光標記，可用于篩選敲除的陽性細胞）。構建重組質(zhì)粒PGL3-U6-sgRNA及pmCherry-EGFP-reporter。酶切驗證重組質(zhì)粒的連接情況。LIP2000法將上述兩種質(zhì)粒及Cas9質(zhì)粒（為鄭州大學中英分子實驗室ProfessorDu友情提供）共轉(zhuǎn)染工具細胞JH293，篩選出內(nèi)源活性sgRNA。另用LIP2000法將EGF

5、P質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞，篩選最佳轉(zhuǎn)染比例。
　?。?）LIP2000法將上述驗證具有內(nèi)源活性sgRNA、reporter與Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC109細胞（DMRT2蛋白高表達），根據(jù)載體中熒光蛋白表達情況，熒光顯微鏡下觀察，最終經(jīng)流式分選，收集單個細胞到96孔板，培養(yǎng)單克隆細胞。
　?。?）提取存活的單克隆細胞基因組。在sgRNA對應細胞基因組序列的上下游設計引物，pcr出該片段，連接T-SIMPLE，轉(zhuǎn)化大腸桿菌

6、超級感受態(tài)，搖菌擴大培養(yǎng)，菌液送基因測序，同時提取單克隆細胞的蛋白，Westernblot驗證DMRT2敲除情況。
　　（5）利用本實驗室IncuCyteZOOM儀器，進行相關細胞功能實驗，包括：細胞增殖實驗、細胞劃痕實驗、細胞侵襲實驗等。此外利用流式檢測分析早期細胞凋亡比例，最后統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，推測該基因?qū)毎鲋?、遷移及凋亡的影響。
　　研究結果：
　　（1）半定量Westernblot法分析5株食管鱗癌細胞株中DM

7、RT2蛋白表達情況，其中高表達細胞株：EC109、EC9706、K30、HKESC1，低表達細胞株：K510。
　?。?）EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC109細胞，得出最佳轉(zhuǎn)染比例為1:4，在DMRT2exon上設計處數(shù)個sgRNA，分別轉(zhuǎn)染工具細胞，最終篩選出內(nèi)源活性最好的sgRNA3:accggagctggaagaggacgtctg。將驗證內(nèi)源活性的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染EC109,經(jīng)流式分選，培養(yǎng)單克隆細胞，再通過基因測序及Westernbl

8、ot驗證，最終得到DMRT2敲除細胞株1株，部分敲除細胞株4株。
　?。?）選擇DMRT2敲除的細胞株EC1091-8（-/-）和敲低細胞株4-8（+/-）與野生型EC109進行功能實驗比較。結果如下：①細胞增殖實驗EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）比野生型EC109細胞增殖能力強，差異有統(tǒng)計學意義。②劃痕遷移實驗通過觀察三組的遷移速率，發(fā)現(xiàn)早期野生型EC109較EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）遷移速率快，但

9、24h以后EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）細胞遷移速率加快，野生型EC109遷移速率減慢。③侵襲實驗加入Matrigel膠后比較各組侵襲速率，發(fā)現(xiàn)三組遷移速率差異不明顯。④流式檢測凋亡實驗先用0.2mmol/L雙氧水誘導細胞凋亡12小時后，凋亡試劑盒檢測，流式分析顯示EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）細胞早期凋亡比率多于野生型EC109細胞。
　　結論：
　　1.DMRT2基因參與腫瘤細胞增殖、遷移，并