Homer1a在創(chuàng)傷性腦損傷中的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是致死致殘的重要病因之一。在美國每年約有200萬人發(fā)生TBI，幾乎三分之一腦損傷的患者是兒童和青年人群。在世界范圍內，TBI的發(fā)生率還在不斷增加，交通事故、人身攻擊等是TBI發(fā)生的主要原因，尤其是機動車輛的廣泛使用，以及戰(zhàn)爭環(huán)境下的爆炸傷是導致TBI的重要原因。
　　創(chuàng)傷性腦損傷的傷情非常復雜，可能會導致不同程度的挫傷、彌漫性軸索損傷、出血、缺氧和神經退行性疾病，從病理生理學角度上，創(chuàng)傷

2、性腦損傷大致可分為兩個階段即：原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損害，原發(fā)性損傷源于環(huán)境中機械外力直接作用于顱骨和腦，瞬間造成腦部神經細胞死亡，屬于不可逆的機械損傷。而繼發(fā)性腦損害是指在原發(fā)性損傷的基礎上，所產生的后續(xù)腦組織損傷，可持續(xù)少至數(shù)小時，多達數(shù)天。繼發(fā)性腦損害機制包括一系列過程，如興奮性神經遞質的釋放（谷氨酸興奮毒性）、線粒體功能障礙、神經細胞凋亡、脂質降解、炎性反應、鈣超載和自由基損傷等。上述機制被證明與細胞早期死亡、程序性細胞死亡以及

3、細胞內部的自噬相關，此過程需要比較長的時間，其中還存在許多可調節(jié)的生物分子靶點，這些生物分子靶點研究在創(chuàng)傷性腦損傷的診斷和治療中可能發(fā)揮重要作用，因此，對繼發(fā)性神經損害相關的生物靶向分子和信號通路進行調控，已逐漸在治療創(chuàng)傷性腦損傷中形成共識。據(jù)研究報道，Homer是重要的突觸后致密物的支架蛋白，Homer1作為Homer蛋白家族的一員，具有形成突觸結構和介導突觸后信號轉導的功能。進一步研究證明，由即早基因編碼的Homer1亞型蛋白，具有

4、調節(jié)受體聚集和轉運、維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)和形成細胞內分子復合物等功能。大量的臨床前研究已經證明，Homer1亞型蛋白與許多神經系統(tǒng)疾病，如疼痛、精神發(fā)育遲緩綜合征，阿爾茨海默病、精神分裂癥、藥物成癮癥和創(chuàng)傷性腦損傷等疾病相關。Homer1a（也稱為vesl-1，短型Homer1），是第一個被分離出來的Homer亞型蛋白。研究表明，Homer1a蛋白由即早基因（IEG）編碼，正常狀態(tài)下維持低水平表達，在神經元激活后表達量迅速增高。然而，單一的

5、生物標記物不足以反映腦組織損傷的全譜。病理狀態(tài)下的關鍵分子、信號通路和網(wǎng)絡依然有待于深入探索。
　　實驗目的:
　　本研究目標：(1)建立穩(wěn)定的腦損傷模型并觀察其病理學、形態(tài)學及行為學變化。使用蛋白質譜的方法系統(tǒng)性鑒定分析創(chuàng)傷性腦損傷后蛋白的變化差異，為其潛在的發(fā)生機制提供新依據(jù)。(2)研究Homer1a蛋白在創(chuàng)傷性腦損傷后的改變與作用，并使用蛋白質譜的方法探索Homer1a下游分子網(wǎng)絡及信號通路的變化，包括MAPK及Not

6、ch等。
　　實驗方法:
　　(1)動物模型：使用C57BL/6小鼠建立重物自由落體閉合性腦損傷模型；(2)腦損傷的評估:腦含水量和神經功能評分；(3)病理學：HE染色、免疫熒光、免疫組化及TUNEL染色；(4)分子生物學：實時熒光定量PCR、反轉錄PCR及免疫印跡法進行研究；(5)動物行為學：曠場實驗、高架迷宮實驗及水迷宮實驗；(6)Homer1a表達調節(jié)研究:皮層注射Homer1a過表達載體、Homer1a基因敲除小鼠。

7、(7)蛋白組學：運用一維凝膠電泳結合非標記定量蛋白組方法、Gene ontology(GO)和Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件的應用；
　　實驗結果:
　　創(chuàng)傷性腦損傷可引起腦水腫和神經功能失調；HE染色結果顯示，損傷后24小時小鼠皮層及海馬中神經元細胞死亡數(shù)目明顯增加，神經元細胞發(fā)生核固縮現(xiàn)象。TUNEL染色結果顯示 TUNEL陽性細胞數(shù)目亦明顯增多。Western blot結果顯示，Ho

8、mer1a在創(chuàng)傷性腦損傷后出現(xiàn)表達升高，而Homer1b/c則未出現(xiàn)明顯變化，免疫熒光及免疫組化結果同上。通過認知學及動物行為學方法（水迷宮、高架十字迷宮及曠場試驗），結果顯示，創(chuàng)傷性腦損傷可造成小鼠學習記憶功能的損害，并產生嚴重的抑郁。蛋白組學結果，大量蛋白及信號通路參與創(chuàng)傷性腦損傷的過程，其中包括經典的損傷標記物GFAP及S100B等，還包括Homer家族分子(Homer1,Homer2及Homer1a)。
　　為進一步研究，

9、我們使用了Homer1a基因敲除小鼠以及Homer1a過表達載體。通過上調Homer1a，可有效降低腦水腫的程度及神經功能評分，在Homer1a基因敲除小鼠則會加重腦水腫的程度和神經功能失調。Western blot結果顯示，腦損傷后24小時活化caspase-3的表達在野生型小鼠中明顯升高，Homer1a基因敲除后表達升高更加明顯，而上調Homer1a則降低腦損傷后活化caspase-3的表達。動物行為學結果顯示，上調Homer1a可

10、以在一定程度上逆轉腦損傷引起的學習記憶損害及焦慮情緒，而Homer1a基因敲除的作用相反。利用質譜分析Homer1a基因敲除后蛋白組的變化，在檢測出的6529種蛋白中，237種蛋白表達差異在2倍以上，生物信息學軟件分析出泛素化信號通路, axonal guidance通路,蛋白激酶A通路, ERK/MAPK通路及Notch通路參與其中。通過功能疾病數(shù)據(jù)庫分析，Homer1a基因敲除可影響基底節(jié)細胞功能、突觸功能等。研究顯示，Homer1

11、a基因敲除后p-ERK,p-CREB和 NICD的表達升高，GluR1及GluR2/3的表達降低。
　　實驗結論:
　　實驗數(shù)據(jù)表明，Homer1a在創(chuàng)傷性腦損傷后具有神經保護的功能，可有效降低TBI后腦水腫的程度及神經功能評分，在一定程度上逆轉TBI引起的學習記憶損害及焦慮情緒，并抑制神經細胞死亡。Homer1a可參與多種信號通路及分子網(wǎng)絡，發(fā)揮著重要的作用，特別是在泛素化信號通路, ERK/MAPK通路及Notch通路的