表面附著、休眠對(duì)白色念珠菌生物膜滯留菌形成的影響及滯留菌相關(guān)基因的初步篩選.pdf

1、白色念珠菌（Canidida albicans）是人類口腔的常駐微生物群的組分之一及最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)條件致病真菌，當(dāng)宿主機(jī)體免疫力降低時(shí)可引起體表以及深部組織器官的內(nèi)源性感染。白色念珠菌同時(shí)也是醫(yī)院獲得性感染最常見(jiàn)的真菌病原體。白色念珠菌感染對(duì)于免疫力缺陷患者如艾滋病、癌癥及器官移植等患者，后果尤為嚴(yán)重。雖然念珠菌感染發(fā)病率在各個(gè)國(guó)家地區(qū)有所不同，但來(lái)自美國(guó)、歐洲、拉美國(guó)家及亞洲等地的流行病學(xué)資料均顯示念珠菌感染率過(guò)去十年里顯著增加。念珠菌

2、感染經(jīng)常難以治愈，有時(shí)甚至?xí)＜吧诿庖呷毕莼颊卟l(fā)念珠菌感染而導(dǎo)致的死亡率高達(dá)40-70％，大多數(shù)患者死于繼發(fā)性念珠菌感染，而非死于原發(fā)疾病。大量研究資料表明絕大多數(shù)慢性白色念珠菌感染與其在宿主體內(nèi)形成的生物膜密切相關(guān)，生物膜的藥物耐受則是導(dǎo)致感染治療失敗或預(yù)后差的主要原因。生物膜的藥物耐受性的主要機(jī)制有生物膜內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢及密度閾值感應(yīng)現(xiàn)象、生物膜胞外聚合物的屏障作用、藥物輸出泵基因表達(dá)上調(diào)及應(yīng)激反應(yīng)等等。隨著對(duì)生物膜耐藥機(jī)制研

3、究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明生物膜的藥物耐受現(xiàn)象是由多因素導(dǎo)致的，上述因素?zé)o法完全解釋生物膜出現(xiàn)的藥物耐受現(xiàn)象。
　　2006年，Lafleur等人發(fā)現(xiàn)白色念珠菌生物膜中有極少數(shù)細(xì)胞可以耐受致死劑量的抗真菌藥物而不被殺滅。這部分幸存細(xì)胞被稱為滯留菌細(xì)胞。收集幸存的滯留菌細(xì)胞再培養(yǎng)后，藥敏實(shí)驗(yàn)顯示其最低抑菌濃度(MIC)值并沒(méi)有增高;并可以形成新的生物膜，再次接受高濃度抗真菌藥物沖擊后，絕大多數(shù)細(xì)胞仍然被殺滅，僅有與原始菌株相似

4、水平的極少數(shù)滯留菌細(xì)胞幸存。與細(xì)菌滯留菌相似，白色念珠菌滯留菌是具有多藥耐藥性，不具備遺傳特性的表型變異細(xì)胞，被認(rèn)為是生物膜耐藥的主要原因。2009年，Lafleur等人在對(duì)從46位長(zhǎng)期接受化療的癌癥患者口腔中檢測(cè)分離出的150株白色念珠菌臨床菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，臨床菌株產(chǎn)生滯留菌的水平與其在患者口腔內(nèi)持續(xù)的時(shí)間有關(guān)。產(chǎn)生高比例滯留菌的臨床分離株來(lái)自每一個(gè)連續(xù)8周以上的白色念珠菌攜帶患者。這一結(jié)果與K.Lewis教授實(shí)驗(yàn)小組的研究結(jié)果類

5、似，他們通過(guò)持續(xù)監(jiān)測(cè)一個(gè)囊性纖維化病人銅綠假單胞菌產(chǎn)生滯留菌能力，發(fā)現(xiàn)隨著病程的延長(zhǎng)，檢出的菌株產(chǎn)生滯留菌的能力逐漸增強(qiáng)，晚期檢出的菌株產(chǎn)生的滯留菌的比例較早期檢出的菌株高達(dá)100倍以上。這些發(fā)現(xiàn)直接將致病微生物產(chǎn)生滯留菌能力與臨床事實(shí)聯(lián)系了起來(lái)，提示滯留菌與臨床感染密切相關(guān)，很可能是臨床上導(dǎo)致抗菌藥物治療失敗，感染癥狀遷延不愈及反復(fù)發(fā)作的主要原因。此外，我們研究小組用兩性霉素B治療分別被產(chǎn)生高、低比例滯留菌的白色念珠菌臨床菌株感染的秀

6、麗隱桿線蟲(chóng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染高比例滯留菌菌株的線蟲(chóng)生存率明顯低于感染低比例滯留菌菌株的線蟲(chóng)。這一發(fā)現(xiàn)再次證實(shí)了白色念珠菌生物膜中少數(shù)耐藥滯留菌是臨床上慢性白色念珠菌感染藥物治療失敗及癥狀反復(fù)遷延不愈的主要原因。
　　白色念珠菌滯留菌是生物膜中的一小部分處于休眠狀態(tài)，不生長(zhǎng)的，具有多藥耐藥性，不具備遺傳特性的表型變異型微生物亞群，被認(rèn)為是復(fù)發(fā)性慢性念珠菌感染的主要原因。然而白色念珠菌滯留菌的形成機(jī)制目前尚不明確，對(duì)于臨床治療造成很大困難

7、。白色念珠菌滯留菌不同于細(xì)菌滯留菌，迄今僅在生物膜中檢出，但是生物膜如何觸發(fā)誘導(dǎo)滯留菌形成仍然不清楚。2006年，Lafleur等發(fā)現(xiàn)一些無(wú)法形成正常生物膜而僅能形成單層稀疏的孢子相生物膜的變異菌株同樣也可以形成野生菌株水平的滯留菌。這一發(fā)現(xiàn)提示念珠菌滯留菌的形成可能是與粘附有關(guān)，并不依賴于生物膜復(fù)雜的空間立體結(jié)構(gòu)的形成。然而，之前有關(guān)念珠菌滯留菌的研究均是集中于48 h成熟生物膜中滯留菌的形成，缺乏對(duì)于早期生物膜中滯留菌形成的研究，需

8、要進(jìn)一步研究。
　　此外，由于白色念珠菌滯留菌在生物膜中所占的比例很小，以及其瞬時(shí)可逆性表型特征，導(dǎo)致分離收集滯留菌進(jìn)行研究十分困難。滯留菌被認(rèn)為是不生長(zhǎng)繁殖的、處于休眠狀態(tài)的表型變異細(xì)胞。而這種休眠細(xì)胞的特征被認(rèn)為是靜止的代謝活動(dòng)，如核酸合成和蛋白質(zhì)合成。這也解釋了抗真菌藥物無(wú)法清除滯留菌的原因，因?yàn)樗幬镒饔玫陌l(fā)揮需要與活躍的特異性作用靶點(diǎn)結(jié)合。2013年Kwan等發(fā)現(xiàn)通過(guò)相應(yīng)的抗生素藥物抑制轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程及三磷酸腺苷ATP的形

9、成，可以極大地增加大腸埃希桿菌滯留菌的形成。這一發(fā)現(xiàn)表明抑制合成代謝似乎是細(xì)菌滯留菌形成的主要機(jī)制，并且為分離研究滯留菌提供了可能。據(jù)此，我們推測(cè)抑制核酸和蛋白的合成可能促進(jìn)白色念珠菌滯留菌的形成。
　　目的:
　　1.擬動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)白色念珠菌滯留菌在生物膜形成過(guò)程中，尤其是在粘附階段中的形成情況，以進(jìn)一步闡釋滯留菌形成與早期生物膜，尤其是粘附階段可能的關(guān)系。
　　2.在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)噲D通過(guò)5-氟胞嘧啶預(yù)處理誘導(dǎo)白色念珠

10、菌細(xì)胞進(jìn)入“休眠”狀態(tài)，檢測(cè)休眠是否可以促進(jìn)滯留菌的形成，以期為分離研究滯留菌提供理論基礎(chǔ)。
　　3.以粘附階段的早期生物膜為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)生物膜細(xì)胞群進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析基因表達(dá)變化，初步篩選出與滯留菌形成相關(guān)的可疑基因，從而為進(jìn)一步探索白色念珠菌滯留菌形成相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的具體機(jī)制提供基礎(chǔ)，以期為研究新型抗真菌藥物提供新的靶點(diǎn)，為臨床治療頑固性復(fù)發(fā)性念珠菌感染、清除滯留菌提供新的思路。
　　方法:
　　1.白色

11、念珠菌滯留菌是在用高濃度兩性霉素B及氯己定沖擊白色念珠菌生物膜后出現(xiàn)兩段式殺滅曲線時(shí)首次被發(fā)現(xiàn)的。自滯留菌被發(fā)現(xiàn)證實(shí)后，劑量依賴性殺滅曲線一直是滯留菌分離研究的唯一直接有效的方法。本實(shí)驗(yàn)中我們采用了類似的方法通過(guò)兩性霉素B（100μg/ml）來(lái)確定白色念珠菌滯留菌，共有3株白色念珠菌菌株用于檢測(cè)滯留菌的形成。首先用白色念珠菌株CAI-4預(yù)先覆蓋96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板的表面，并在顯微鏡下觀察確認(rèn)附著表面已被完全覆蓋。我們通過(guò)誘導(dǎo)測(cè)試白色念珠菌

12、菌株在是否與附著表面直接粘附的情況下形成早期生物膜，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)在生物膜形成過(guò)程中滯留菌的產(chǎn)生。滯留菌的確定基于兩性霉素B作用后對(duì)細(xì)胞活力的評(píng)估。此外，我們還在加入兩性霉素B處理生物膜的同時(shí)通過(guò)刮擦破壞附著的情況下，檢測(cè)了生物膜中滯留菌細(xì)胞水平。
　　2.5-氟胞嘧啶是目前臨床上應(yīng)用的唯一具有抑制核酸和蛋白合成的抗真菌藥物。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)噲D用5-氟胞嘧啶誘導(dǎo)白色念珠菌細(xì)胞進(jìn)入休眠來(lái)增加滯留菌的形成，共有8株白色念珠菌菌株用于實(shí)驗(yàn)。

13、白色念珠菌細(xì)胞被5-氟胞嘧啶（浮游細(xì)胞:0.8μg/ml;生物膜細(xì)胞:1μg/ml）在37℃預(yù)處理6h。通過(guò)對(duì)5-氟胞嘧啶預(yù)處理期間白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)的核酸水平的檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞是否被成功誘導(dǎo)進(jìn)入休眠狀態(tài)。經(jīng)5-氟胞嘧啶預(yù)處理后的白色念珠菌生物膜及浮游相培養(yǎng)物經(jīng)兩性霉素B作用后通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)來(lái)確認(rèn)滯留菌形成的情況。
　　3.收集不同時(shí)間點(diǎn)的早期生物膜細(xì)胞(0，0.5，1，1.5，2，4h)，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控分

14、析合格后，則進(jìn)行后續(xù)分析，包括基因表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)及注釋、SNP檢測(cè)等一系列后續(xù)分析，并從基因表達(dá)結(jié)果中，篩選出樣品間差異表達(dá)的基因。結(jié)合在生物膜形成早期階段(0-2 h)滯留菌水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果，初步篩選出與白色念珠菌耐藥滯留菌形成相關(guān)的可疑基因。然后進(jìn)一步對(duì)初步篩選的可疑基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析。
　　結(jié)果:
　　1.一旦白色念珠菌細(xì)胞附著到表面，即可檢出滯留

15、菌，其比例大約在2h生物膜中達(dá)到峰值。隨著生物膜的成熟，滯留菌的比例不斷下降，在24 h成熟生物膜中僅占0.01-0.02％，滯留菌數(shù)量自2h后保持穩(wěn)定沒(méi)有明顯改變。在形成于被其他菌株預(yù)先覆蓋表面的生物膜中，及在接受兩性霉素B治療同時(shí)被破壞表面附著的生物膜中，均未檢出滯留菌細(xì)胞。
　　2.5-氟胞嘧啶預(yù)處理成功地誘導(dǎo)白色念珠菌細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)。然而，在接受5-氟胞嘧啶預(yù)處理的浮游培養(yǎng)物，與未接受預(yù)處理的對(duì)照浮游培養(yǎng)物類似，未檢測(cè)到

16、滯留菌的形成。在所有測(cè)試菌株的生物膜中均檢測(cè)到滯留菌，但是在經(jīng)5-氟胞嘧啶預(yù)處理的生物膜中滯留菌的形成均未顯著增加，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.基因轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在白色念珠菌與附著表面接觸30min內(nèi)即可發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)方面的差異。結(jié)合白色念珠菌滯留菌水平在早期階段生物膜(0-2 h)中的變化趨勢(shì)，共有228個(gè)基因被初步確認(rèn)可能與白色念珠菌生物膜滯留菌形成相關(guān)。在生物膜形成早期階段(0-2 h)中，基因表達(dá)變化趨勢(shì)與白色念珠菌滯留菌

17、形成變化趨勢(shì)一致的基因約有97個(gè)，與白色念珠菌滯留菌在早期生物膜中形成變化趨勢(shì)相反的基因約有131個(gè)。
　　結(jié)論:
　　1.僅在白色念珠菌細(xì)胞與附著表面直接粘附而形成的生物膜中檢出滯留菌，且主要產(chǎn)生于早期生物膜形成的粘附階段。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)表面粘附，而非生物膜結(jié)構(gòu)的形成，是白色念珠菌滯留菌形成和維持所必需的。白色念珠菌細(xì)胞與附著表面的粘附可能先于生物膜形成觸發(fā)了某未知細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致少數(shù)細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)入休眠狀態(tài)，由常規(guī)