Cdc42調(diào)控長(zhǎng)骨發(fā)育機(jī)制研究.pdf

1、人類疾病中有許多是與骨相關(guān)的，如骨質(zhì)疏松、軟骨發(fā)育不良、骨性關(guān)節(jié)炎等。因此，深入研究骨發(fā)育的分子機(jī)制對(duì)于疾病診斷、預(yù)防和治療意義重大。
　　脊椎動(dòng)物的骨形成主要有兩種形式:膜內(nèi)成骨（Intramembranous ossification）和軟骨內(nèi)成骨(Endochondral ossification)。軟骨內(nèi)成骨過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，起始于肢芽間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和聚集，然后會(huì)先后經(jīng)歷軟骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞肥大化、肥大軟骨

2、細(xì)胞成熟凋亡、血管入侵及成骨分化步驟。
　　Rho家族的小G蛋白(Rho small GTPase)成員包括Rac1、Cdc42和RhoA，可以在GTP形式與GDP形式間轉(zhuǎn)換，從而作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑的“分子開(kāi)關(guān)”調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、基因轉(zhuǎn)錄活性、信號(hào)傳導(dǎo)等重要功能。近幾年有報(bào)道指出Rac1可以調(diào)控經(jīng)典Wnt信號(hào)促進(jìn)成骨分化，基因敲除小鼠與體外細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果顯示Rac1與Cdc42調(diào)控軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，但具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。

3、
　　我們通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)研究及條件性敲除小鼠研究揭示了Cdc42在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中具有重要作用，并對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了一定的探討，對(duì)軟骨內(nèi)成骨的機(jī)制及Rho家族小G蛋白的功能進(jìn)行了很好的補(bǔ)充。
　　小鼠肢芽組織由頂外胚層嵴(Apical ectodermal ridge，AER)信號(hào)中心與極化活性區(qū)（Zone of polarizing activity，ZPA）兩部分組成。首先我們通過(guò)觀察頂端外胚層嵴敲除Cdc42（Msx2

4、Cre;Cdc42f/f）的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)Cdc42并不參與調(diào)控頂外胚層嵴的活性。間充質(zhì)細(xì)胞敲除Cdc42（PrxCre;Cdc42f/f）的小鼠呈現(xiàn)出四肢短粗、顱骨開(kāi)放性缺失的表型，進(jìn)一步的組織切片H&E染色發(fā)現(xiàn)Cdc42敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠股骨中心有過(guò)度增生的肥大軟骨細(xì)胞，不能出現(xiàn)正常的血管入侵。上述表型充分說(shuō)明Cdc42參與軟骨內(nèi)成骨過(guò)程。
　　為了明確小鼠骨發(fā)育異常的原因，首先我們?nèi)rxCre;Cdc42f/f的小鼠股骨做

5、成骨與軟骨分化標(biāo)記基因的原位雜交，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞及血管入侵的標(biāo)記基因基本無(wú)異常。另外，在體外細(xì)胞學(xué)上我們分別檢測(cè)了成骨分化標(biāo)記基因的表達(dá)、成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2的熒光素酶報(bào)告基因活性，并進(jìn)行了成骨分化誘導(dǎo)的茜素紅染色明確礦物化結(jié)節(jié)形成能力;在整體動(dòng)物上我們觀察了成骨細(xì)胞特異性敲除Cdc42的轉(zhuǎn)基因小鼠表型，結(jié)果均表明Cdc42基因敲除小鼠的骨骼異常是繼發(fā)于軟骨發(fā)育過(guò)程的，Cdc42并不能直接調(diào)控成骨細(xì)胞的分化，而是調(diào)控軟骨分化。<

6、br>　　軟骨分化過(guò)程起始于間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和聚集，而Sox9是軟骨發(fā)生早期階段的主要決定因子，對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞的聚集是必須的。首先我們檢測(cè)了Sox9的whole mount原位雜交，結(jié)果顯示在E12.5天時(shí)Sox9應(yīng)表達(dá)于尺、橈骨及跖骨形狀的細(xì)胞聚集區(qū)及其軟骨結(jié)構(gòu)的部位，而缺失Cdc42的轉(zhuǎn)基因小鼠中Sox9的表達(dá)彌散于整個(gè)肢芽結(jié)構(gòu)。然后我們通過(guò)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(C3H10T1/2)的微團(tuán)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)敲降Cdc42可以抑制BMP-2所誘導(dǎo)

7、的細(xì)胞聚集，而持續(xù)激活Cdc42可以增強(qiáng)BMP-2的誘導(dǎo)作用。同時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示敲降Cdc42后顯著抑制細(xì)胞聚集的標(biāo)記基因N-cadherin的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說(shuō)明Cdc42在間充質(zhì)細(xì)胞聚集過(guò)程中扮演了重要的角色。
　　為了進(jìn)一步探討Cdc42調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞聚集的機(jī)制，我們?cè)贑3H10T1/2細(xì)胞上開(kāi)展了一系列的研究。Western blot的結(jié)果顯示敲降Cdc42或抑制Pak1均抑制BMP-2誘導(dǎo)的Smad1/5與

8、p38的磷酸化水平;核質(zhì)分離結(jié)果顯示抑制p38或Pak1后抑制了Smad1/5的入核能力;免疫共沉淀的結(jié)果顯示p38與Smad5存在相互結(jié)合。上述結(jié)果說(shuō)明Cdc42調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞聚集可能是通過(guò)Pak1/p38/Smad信號(hào)通路。為了驗(yàn)證此信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞聚集的影響，我們?cè)俅卫肅3H10T1/2細(xì)胞做微團(tuán)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降Smad4或抑制p38的活性都會(huì)抑制BMP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)敲降Cdc42引起的聚集受抑制表型可以通過(guò)添

9、加p38的激動(dòng)劑挽救。最后我們選取PrxCre;Cdc42f/f的小鼠E11.5天的肢芽做免疫組化和westernblot，結(jié)果顯示，與同窩仔比間充質(zhì)細(xì)胞敲除Cdc42的小鼠肢芽中磷酸化的Smad與p38的水平有一定的下降。上述結(jié)果提示我們Cdc42調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞聚集過(guò)程是通過(guò)BMP-2/Pak1/p38/Smad信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　間充質(zhì)細(xì)胞聚集后會(huì)向軟骨細(xì)胞分化，然后發(fā)生肥大化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示，敲降Cdc42或

10、抑制Pak1抑制TGF-β所誘導(dǎo)的軟骨分化的標(biāo)記基因Col2a1的表達(dá);熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示軟骨分化的轉(zhuǎn)錄因子Sox9的熒光素酶報(bào)告基因活性同樣受到了抑制。結(jié)果提示Cdc42同樣參與軟骨細(xì)胞早期分化過(guò)程。進(jìn)一步的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲降Cdc42或抑制Pak1均對(duì)AKT1的活性及Sox9的磷酸化有一定的抑制作用，而且持續(xù)激活A(yù)KT1則能挽救敲降Cdc42導(dǎo)致的Sox9活性受抑制的結(jié)果。細(xì)胞核質(zhì)分離的結(jié)果顯示敲降Cdc42或Pa

11、k1顯著降低了Sox9的入核能力。表明Cdc42調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞早期分化是通過(guò)Pak1激活A(yù)KT1所支配的Sox9的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。
　　同時(shí)我們檢測(cè)了肥大軟骨細(xì)胞的標(biāo)記基因Col10的表達(dá)、肥大軟骨細(xì)胞成熟的轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄活性等，均未發(fā)現(xiàn)Cdc42對(duì)其有影響。我們通過(guò)肥大軟骨細(xì)胞缺失Cdc42（Col10Cre;Cdc42f/f）的轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼制備及H&E染色驗(yàn)證了Cdc42缺失不參與軟骨細(xì)胞的肥大化及成熟過(guò)程。