供體來源樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)體外擴(kuò)增Tregs對受體腫瘤免疫的影響.pdf

1、目的：
　　研究過繼輸注體外擴(kuò)增 Tregs治療是否抑制移植物受體的抗腫瘤免疫，以及體外擴(kuò)增Tregs與供體來源成熟樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)是否能夠誘導(dǎo)Tregs的抗原特異性。
　　方法：
　　1.取C57BL/6（H-2b）小鼠或BALB/c（H-2d）小鼠骨髓細(xì)胞，在重組鼠源性GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)以及TNF-α刺激下分化為成熟樹突狀細(xì)胞。
　　2.免疫磁珠法（MACS）從BALB/c或C57BL/6小鼠脾臟分選

2、出CD4+CD25+Tregs,加入 anti-CD3/CD28磁珠和高濃度重組鼠源性 IL-2（1000U/ml），體外擴(kuò)增14天。
　　3.在給予低濃度重組鼠源性IL-2（200U/ml）的條件下，體外擴(kuò)增后 CD4+CD25+Tregs與成熟樹突狀細(xì)胞（C57BL/6小鼠 CD4+CD25+Tregs與 BALB/c小鼠成熟樹突狀細(xì)胞或者 BALB/c小鼠 CD4+CD25+Tregs與C57BL/6小鼠成熟樹突狀細(xì)胞）混合

3、培養(yǎng)7天。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測成熟樹突狀細(xì)胞及 Tregs純度，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測Tregs體外抑制功能。
　　5.構(gòu)建小鼠皮膚移植模型檢測Tregs體內(nèi)抑制功能。
　　6.分別注射B16-F10（小鼠黑色素瘤細(xì)胞，H-2b）于C57BL/6和BALB/c小鼠，建立小鼠腫瘤模型。
　　7.收集擴(kuò)增后及誘導(dǎo)后Tregs分別過繼輸注于C57BL/6和BALB/c小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后注射B16-F10。
　

4、　8.14天后處死小鼠，觀察肺部腫瘤結(jié)節(jié)并記數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.擴(kuò)增后及誘導(dǎo)后Tregs與新鮮分選Tregs相比，純度和免疫抑制功能無明顯下降。
　　2.擴(kuò)增后及誘導(dǎo)后 Tregs能夠顯著延長同種異體皮膚移植物生存時(shí)間（14.5天Vs9天，p<0.05）。
　　3. C57BL/6小鼠單獨(dú)注射5×105 B16-F10，14天后肺部腫瘤結(jié)節(jié)為93±12個(gè)，預(yù)先輸注1×107體外擴(kuò)增后 Tregs，24小時(shí)后

5、注射5×105 B16-F10，肺部腫瘤結(jié)節(jié)為355±15個(gè)，而預(yù)先輸注1×107誘導(dǎo)后Tregs，24小時(shí)后注射5×105 B16-F10，肺部腫瘤結(jié)節(jié)為195±13個(gè)，相比單獨(dú)注射B16-F10，后兩者肺部腫瘤結(jié)節(jié)明顯增加（p<0.05）。
　　4.單獨(dú)注射5×105 B16-F10，BALB/c小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)為9±6個(gè)，預(yù)先輸注1×107體外擴(kuò)增后Tregs，24小時(shí)后注射5×105 B16-F10，肺部腫瘤結(jié)節(jié)為124±

6、4個(gè)，而預(yù)先輸注1×107誘導(dǎo)后Tregs，24小時(shí)后注射5×105 B16-F10，肺部腫瘤結(jié)節(jié)為297±18個(gè)，與單獨(dú)注射 B16-F10相比，后兩者肺部腫瘤結(jié)節(jié)明顯增加（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過MACS分選，Tregs純度能夠達(dá)到95％以上。
　　2.通過體外擴(kuò)增，我們能夠得到足量的具有免疫抑制功能的Tregs。
　　3.過繼輸注一定數(shù)量體外擴(kuò)增后 Tregs能夠抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，引起