基于脫細胞基質支架的輸尿管組織工程研究.pdf

1、輸尿管作為腹膜后位器官，損傷發(fā)生的機率很低，但近年來隨著腔鏡技術在臨床中的廣泛應用，輸尿管損傷發(fā)生的概率逐年升高。常規(guī)手術治療方式（輸尿管斷端吻合，輸尿管的再植，膀胱成形術等）可以恢復輸尿管結構的連續(xù)性，而不能完全恢復其功能，且常伴有一些術后并發(fā)癥，例如:復發(fā)性狹窄，漏尿以及腎臟損害等。隨著組織工程技術在泌尿系統(tǒng)中的廣泛應用，為輸尿管的修復重建提供了新的契機。
　　組織工程學融合了材料學、生命科學和工程學的理念，屬于前沿交叉學科領

2、域，研究的最終目的是體外構建具有生物學功能的工程化輸尿管，替換體內受損的輸尿管組織，達到臨床治愈的目標。隨著組織工程技術在泌尿系統(tǒng)廣泛而深入的研究，體外構建工程化輸尿管的研究也有了很多突破性的進展，但尚未構建出理想的工程化輸尿管組織，用于臨床的治療。其中支架材料問題是其主要原因之一。輸尿管細胞外基質的結構和成分較為復雜，現階段技術條件很難在體外完全模擬出細胞外基質的微環(huán)境。脫細胞技術的出現和發(fā)展，使得制備脫細胞基質材料成為可能，受到了廣

3、泛的關注和研究。
　　脫細胞基質材料獨有的特點是將細胞成分從組織或器官中清除，同時能夠很好地保留細胞外基質的結構和成分，因而是較為理想的組織工程支架材料。輸尿管脫細胞基質常用的制備方法為物理攪拌同時結合化學洗滌劑的洗脫作用，來達到脫細胞效果，這一制備過程需消耗較長的時間，且制備的輸尿管脫細胞基質的成分常遭到破壞。此外，長時間的攪拌和化學洗滌劑作用，也會破壞脫細胞基質的結構，進而影響組織工程輸尿管的構建。因此，探尋一種快速，便捷的脫

4、細胞方案，使制備的輸尿管脫細胞基質的細胞成分被完全清除，同時細胞外基質結構和成分得到很好地保留，對以后的輸尿管再造研究具有重要的意義。
　　既往的研究報道，細胞外基質在調控干細胞分化中扮演著重要的角色。 DeQuach等人的研究表明，骨骼肌脫細胞基質能夠促進肌源性干細胞向骨骼肌細胞分化，心臟脫細胞基質能夠促進胚胎干細胞向心肌細胞分化。有文獻報道脫細胞基質的硬度在調控間充質干細胞分化起到重要的作用，質地較為堅硬的基質有利于間充質干細

5、胞的成骨分化，相反質地較軟的基質更有利于間充質干細胞的成脂分化。此外，也有關于細胞外基質中某些組分可以促進干細胞的分化的報道。但關于輸尿管脫細胞基質成分在促進干細胞分化方面的研究尚未有報道。
　　基于以上問題的分析，本論文主要從以下三方面進行了相關研究:
　　第一部分:輸尿管脫細胞基質的灌注制備及條件優(yōu)化
　　目的:探索灌注系統(tǒng)在制備輸尿管脫細胞基質中的可行性，并對制備的輸尿管脫細胞基質進行系統(tǒng)且詳細地評價。
　

6、　方法:利用輸尿管本身存在的管腔結構，通過灌注系統(tǒng)制備輸尿管脫細胞基質。根據化學洗滌劑的不同特性設置3個不同的灌注組，單純SDS組、單純TritonX-100組以及聯合組(TritonX-100+SDS)。
　　結果:HE染色和DAPI染色顯示聯合組制備的輸尿管脫細胞基質中沒有明顯的核物質殘留，DNA定量和凝膠電泳證實了這一結果。Masson's三色染色、AlcianBlue染色、膠原含量測定和GAG含量測定顯示聯合組保留了輸尿管

7、脫細胞基質三維膠原結構和生物活性成分。掃描電鏡觀察聯合組制備的輸尿管脫細胞基質表面存在大量的孔隙結構。
　　結論:灌注系統(tǒng)可用于輸尿管脫細胞基質的制備，篩選出一套比較理想的脫細胞方案，制備的輸尿管脫細胞基質可作為輸尿管組織工程再造。
　　第二部分:輸尿管脫細胞基質的生物相容性評價和再細胞化
　　目的:對制備的輸尿管脫細胞基質進行生物相容性評價，并進行再細胞化研究。
　　方法:通過AO/PI染色和MTT檢測評價輸尿

8、管脫細胞基質的生物相容性;將犬膀胱平滑肌細胞種植在輸尿管脫細胞基質的表面，觀察脫細胞基質中細胞的生長行為。
　　結果:AO/PI染色和MTT檢測顯示平滑肌細胞可在輸尿管脫細胞基質浸提液中生長和增殖;HE染色、DAPI染色和PCNA染色顯示犬膀胱平滑肌細胞可在輸尿管脫細胞基質中粘附、生長、遷移和增殖。
　　結論:制備的輸尿管脫細胞基質具有良好的生物相容性，可用做輸尿管組織工程的支架材料。
　　第三部分:輸尿管脫細胞基質的

9、化學成分誘導脂肪干細胞的分化
　　目的:探尋輸尿管脫細胞基質的化學成分是否可誘導干細胞分化。
　　方法:將犬脂肪干細胞種植在鋪有輸尿管脫細胞基質消化液的蓋玻片上，觀察脂肪干細胞的分化情況。
　　結果:免疫熒光染色顯示脂肪干細胞向平滑肌細胞分化，WesternBlot檢測顯示有平滑肌蛋白的表達。
　　結論:輸尿管脫細胞基質的化學成分可以誘導犬脂肪干細胞向平滑肌細胞分化。
　　綜上所述，本論文將灌注系統(tǒng)引入到輸

10、尿管脫細胞基質的制備中，并成功篩選出一套適用于制備犬輸尿管脫細胞基質的脫細胞方案。同時對制備的輸尿管脫細胞基質進行了系統(tǒng)且詳細的評價，證實制備的輸尿管脫細胞基質很好地清除了細胞核成分，同時較好地保留了輸尿管的三維結構和生物活性成分。并且驗證了所制備的輸尿管脫細胞基質具有良好的生物相容性，進行了再細胞化實驗，表明優(yōu)化后的脫細胞方案所制備的輸尿管脫細胞基質可用作輸尿管組織工程的支架材料。進一步研究表明輸尿管脫細胞基質的化學組分可促進犬脂肪干