尿皮素Ⅱ?qū)Υ笫笙虑鹉X室旁核小細(xì)胞分泌神經(jīng)元活動(dòng)的影響.pdf

1、目的：利用急性腦片全細(xì)胞膜片鉗記錄、神經(jīng)藥理學(xué)和組織化學(xué)染色技術(shù)，研究尿皮素Ⅱ(UCNⅡ)對(duì)幼年大鼠PVN分泌型小細(xì)胞自發(fā)性放電和膜電位的影響機(jī)制。
　　方法：本研究使用生后為15-26天（Postnatal day15-26，P15-P26）的Wistar系大鼠，用異氟烷吸入麻醉后，迅速斷頭取腦，然后用振動(dòng)切片機(jī)來(lái)制備含PVN的下丘腦切片，切片厚度為250微米。在室溫下(24-25℃)，將含有下丘腦室旁核的腦切片放置于人工腦脊液

2、(ACSF)中孵育60分鐘以上，對(duì)ACSF持續(xù)充有95％O2和5％ CO2混合氣體。ACSF的組成成分如下:118 mM NaCl，3 mM KCl，1 mM MgCl2.6H2O,1mM NaH2PO4.2H2O,25 mM NaHCO3,10 mM D-Glucose,2mM CaCl2。PH值為7.25-7.35，滲透壓為295-300 mOsM。記錄電極內(nèi)灌裝7微升電極內(nèi)液，內(nèi)液組成成分如下:120mM potassium gl

3、uconate，10mMHEPES，1 mMEGTA，5mMKCl,3.5 mM MgCl2,4mM NaCl,8 mM biocytin,4 mM Na2ATP,0.2 mM Na2GTP。用KOH將pH值調(diào)為7.3。電極阻抗為5-7MΩ。PVN神經(jīng)元電活動(dòng)使用全細(xì)胞膜片鉗系統(tǒng)記錄，收集的數(shù)據(jù)存于電腦硬盤中，并將完整記錄而且基線相對(duì)穩(wěn)定的電生理數(shù)據(jù)用于最后的數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。電生理記錄完成后，將下丘腦片固定于4％多聚甲醛中24小時(shí)

4、以上，然后行DAB染色。在顯微鏡下，觀察神經(jīng)元的位置和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)并拍照獲取染色結(jié)果。電生理的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Clampfit10.4軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用的是SPSS軟件，用配對(duì)T檢驗(yàn)來(lái)比較給藥前后的平均數(shù)，P＜0.05，記錄結(jié)果認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.在電流鉗下（current-clamp recording mode），PVN小細(xì)胞分泌神經(jīng)元對(duì)去極化電流刺激敏感，但沒(méi)有明顯內(nèi)向整流電流、低閾值放電

5、(LTS)和超極化活化內(nèi)向電流(Ih)。
　　2.在電流鉗下，UCNⅡ(100 nM)可導(dǎo)致34.7％的PVN小細(xì)胞分泌神經(jīng)元的放電頻率明顯降低，沖洗20分鐘后恢復(fù)，UCNⅡ?qū)ψ园l(fā)性放電頻率的影響隨UCNⅡ濃度升高而減弱。
　　3.UCNⅡ抑制自發(fā)性放電的同時(shí)，導(dǎo)致膜電位的超極化，UCNⅡ?qū)е碌哪る娢怀瑯O化對(duì)河豚毒素(TTX)不敏感。
　　4.在TTX存在條件下，UCNⅡ?qū)е碌腜VN小細(xì)胞分泌神經(jīng)元膜超極化具有劑量依存