孕期炎癥刺激對子代大鼠心臟損傷危險因素敏感性的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　心血管疾病是威脅人類健康的重要因素之一。目前，心血管疾病已經(jīng)超越腫瘤等慢性非傳染性疾病，成為全世界死亡率最高的疾病，其死亡率達到了31％。盡管針對治療和預防心血管疾病的研究和投入是所有慢性非傳染性疾病中最昂貴的，其發(fā)病率和死亡率仍然每年在增長，提示其他重要發(fā)病因素的存在。大量臨床和動物實驗數(shù)據(jù)表明，孕期暴露于營養(yǎng)不良、缺氧等不利環(huán)境，會導致子代成年對心血管疾病的危險因素敏感性增高，從而更容易罹患心血管疾病，甚至誘發(fā)嚴重

2、的心血管事件。我室在利用脂多糖和酵母多糖成功構建子代成年大鼠高血壓模型的基礎上，發(fā)現(xiàn)孕中期接受脂多糖刺激，與正常組相比，其子代大鼠成年后隨年齡增長逐漸出現(xiàn)心肌纖維化和心肌重構，并導致舒張功能下降，這種心肌重構和舒張功能的下降可能與心臟NF-κB通路和心臟局部RAAS異常激活有關，但具體機制及其對子代成年心血管疾病易感性的影響仍不明確。目前，對于心臟疾病易感性的起因和機制研究主要集中在成年個體，因此，本研究結果可能擴大心臟疾病預防和治療的

3、時間窗，將防治心臟疾病的時間追溯到了生命早期。
　　方法:
　　1.孕鼠處理方案:SD孕鼠隨機分為兩個組(每組9-10只):對照組、LPS組。LPS組孕鼠分別在孕第8、10、12天給予腹腔注射LPS0.79mg/kg，對照組孕鼠給予腹腔注射生理鹽水。子代大鼠三周齡斷奶，正常飼養(yǎng)至出生后第20周。
　　2.子代大鼠處理方案:對照組和LPS組的子代大鼠20周齡時，分別隨機分為4組(每組6只):LPS組子代大鼠分別給予皮下注

4、射生理鹽水，異丙腎上腺素(ISO)5mg/kg/day，皮下注射ISO+腹腔注射SB2021900.4mg/kg/day，皮下注射ISO+口服NAC2.5mg/kg/day，分別定義為LPS+Ve、LPS+ISO、LPS+ISO+SB202190和LPS+ISO+NAC組，對照組子代大鼠采取與LPS組子代大鼠一致的處理方式，定義為Con+Ve、Con+ISO、Con+ISO+SB202190和Con+ISO+NAC組，刺激時間為兩周。I

5、SO急性刺激實驗中，對照組和LPS組的子代大鼠20周齡時，分別隨機分為2組(每組6只)，一次性分別給予皮下注射生理鹽水和ISO(5mg/kg)。
　　3.高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)評價子代大鼠心臟功能和心臟血流動力學。
　　4.HE染色法評價子代大鼠心肌細胞總體形態(tài)、心肌細胞大小;Masson三色染色法評價心肌纖維化和膠原沉積。
　　5.冰凍組織切片DHE熒光染色評價子代大鼠心臟活性氧簇表達。
　　6.Real-

6、time PCR檢測子代大鼠心臟左室組織中活性氧產(chǎn)生和清除相關基因(Nox2、Nox4、Sod1、Sod2)的mRNA表達情況和心肌肥厚和纖維化相關基因(α-MHC、β-MHC、ANP、BNP、Col1a1、Col3a1、Mmp2、Mmp9)的mRNA表達。
　　7.Western blot法檢測子代大鼠心臟組織中p38、JNK MAPK信號通路蛋白表達以及α-MHC、β-MHC等心肌重構相關蛋白表達。
　　結果:
　

7、　1.孕期炎癥刺激對子代成年大鼠心臟結構和功能的影響
　　1.1與對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左室室間隔厚度(IVST)顯著增加、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDS)顯著降低(P＜0.05)，左室中膠原容積分數(shù)(CFV％)、主要的膠原類型Col1a1和及其降解酶Mmp9表達增加(P＜0.05)，表明孕期炎癥刺激子代大鼠存在明顯的心肌重構。
　　1.2與對照組子代大鼠相比，LPS孕期炎癥刺激子代大鼠心臟左室射血分數(shù)(LV

8、EF％)、左室短軸縮短率(LVFS％)顯著升高(P＜0.05)，說明孕期炎癥刺激子代大鼠存在明顯心臟功能改變。
　　2.孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO刺激心臟損傷敏感性增加
　　2.1 ISO刺激兩周，正常對照組子代大鼠心臟重量指數(shù)(HMI)和左心室重量指數(shù)(LVMI)明顯增加(P＜0.001)，但相同刺激下，孕期炎癥刺激子代大鼠HWI和LVMI顯著增加(P＜0.001)，且增加幅度明顯高于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.0

9、01)。
　　2.2 ISO刺激兩周，正常對照組子代大鼠左室與心肌肥厚相關的胚胎基因β-MHC表達降低(P＜0.05)、ANP表達增加(P＜0.01)、BNP和非胚胎基因α-MHC表達無顯著差異(P＞0.05)，α-MHC/β-MHC表達顯著升高(P＜0.01)。而孕期炎癥刺激子代大鼠左室與心肌肥厚相關的胚胎基因β-MHC、ANP、BNP表達顯著增加(P＜0.01);與正常對照組子代大鼠不同的是，非胚胎基因α-MHC表達顯著降低(

10、P＜0.01)，α-MHC/β-MHC差異無論在mRNA水平和蛋白水平都顯著降低(P＜0.01)，且低于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.05)。這說明孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導的心肌肥厚敏感性增加。
　　2.3 ISO刺激兩周，正常對照組子代大鼠膠原容積分數(shù)(CVF％)、左室中主要存在的膠原類型Col1a1、Col3a1及其降解酶Mmp2表達顯著增加(P＜0.01);相同刺激條件下，孕期炎癥刺激子代大鼠膠原容積分數(shù)(CVF

11、％)、左室中主要存在的膠原類型Col1a1、Col3a1及其降解酶Mmp2表達也顯著增加(P＜0.01)，且增加幅度高于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.05)。說明孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導的心肌纖維化敏感性增加。
　　3.孕期炎癥刺激導致子代大鼠對ISO誘導的心臟損傷敏感性增加的機制研究
　　3.1 活性氧產(chǎn)生與清除失衡介導的孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導心臟損傷敏感性增加。
　　3.1.1 沒有ISO刺激

12、的情況下，通過超氧化物陰離子水平熒光探針DHE染色顯示，與對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠心臟組織DHE熒光染色強度有增加趨勢，但無顯著差異。ISO連續(xù)刺激兩周，對照組子代大鼠心臟中DHE染色熒光強度顯著增加(P＜0.01)，孕期炎癥刺激子代大鼠心臟中DHE染色熒光強度也顯著增加(P＜0.001)，且顯著高于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.001)。
　　3.1.2 與正常對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促

13、進ROS生成的NADPH氧化酶(如Nox2、p47phox)mRNA表達顯著增加(P＜0.05)，NOX2在蛋白水平表達也有增加趨勢，說明孕期炎癥刺激子代大鼠存在ROS激活。ISO刺激兩周后，對照組子代大鼠左室中促進ROS生成的NADPH氧化酶(如Nox2、p67phox)mRNA表達顯著增加(P＜0.01)，Nox4和p22phoxmRNA表達也有增加趨勢，但無顯著差異;相同刺激條件下，孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進ROS生成的NAD

14、PH氧化酶(如Nox2、p67phox、Nox4和p22phox)mRNA表達也顯著增加(P＜0.01)，且顯著高于相同刺激的對照組子代大鼠(P＜0.05 or0.01)。NOX2在蛋白水平的表達趨勢與mRNA水平一致。
　　3.1.3 與正常對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進ROS清除的Sod1、Sod2、Sod3、catalase mRNA表達顯著增加(P＜0.05 or0.01)，SOD1蛋白表達水平也顯著增

15、加(P＜0.05)。ISO刺激兩周后，對照組子代大鼠左室中促進ROS清除的Sod1、Sod2、Sod3、catalase mRNA表達顯著降低(P＜0.05 or0.01)，而孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進ROS清除的Sod1、Sod2、Sod3、catalase和Gpx-1 mRNA表達也顯著降低(P＜0.01 or0.001)，且低于相同刺激對照組子代大鼠的趨勢，但無顯著差異。SOD1和SOD2蛋白表達水平與mRNA水平一致。

16、>　　3.1.4 抗氧化劑NAC能降低ISO導致的孕期炎癥刺激子代大鼠心肌纖維化，提高心肌收縮能力。
　　3.2 p38 MAPK激活介導的孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導心臟損傷敏感性增加。
　　3.2.1 與正常對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左心室p-p38表達顯著增加(P＜0.05)，說明孕期炎癥刺激子代大鼠左室中p38 MAPK被激活。
　　3.2.2 無論是否用ISO刺激，孕期炎癥刺激子代大鼠左室p

17、-p38表達比相同刺激的正常對照組子代大鼠顯著增加(P＜0.05)。ISO刺激兩周后，正常對照組和孕期炎癥刺激子代大鼠左室中p-p38表達都無顯著改變(P＞0.05)。
　　結論:
　　1.孕期炎癥刺激導致子代成年大鼠對ISO誘導的心肌損傷敏感性增加，主要表現(xiàn)為左心室肥厚，心肌纖維化程度加重，左室收縮功能顯著降低。
　　2.活性氧生成與清除失衡是導致孕期炎癥刺激子代成年大鼠對ISO誘導的心肌損傷敏感性增加的機制之一，抗