PTSD大鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元PERK信號(hào)通路應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　我們課題組發(fā)現(xiàn)PTSD模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，發(fā)生細(xì)胞凋亡的途徑有三種:死亡受體徑路;線粒體徑路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡是備受矚目的細(xì)胞凋亡通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，它不僅能夠合成蛋白還是鈣的儲(chǔ)存場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。但是諸多生理或病理因素可導(dǎo)致未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白產(chǎn)生并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplas

2、mic reticulum stress，ERS)，啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，UPR是通過增加分子伴侶的表達(dá)來促進(jìn)蛋白的正確折疊，減少錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的產(chǎn)生，來減少ERS對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)造成的傷害。應(yīng)答UPR的機(jī)制是通過三條信號(hào)通路完成的:蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like，PERK)，肌醇需酶1(Inositol Requiring enzyme1，I

3、RE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(Activating Transcription factor6，ATF6)。PERK，ATF6和IRE1三個(gè)UPR信號(hào)分子可激活其下游的信號(hào)分子，達(dá)到抑制蛋白質(zhì)的合成的作用，來恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。研究表明，PERK信號(hào)通路在細(xì)胞保護(hù)與細(xì)胞凋亡過程中起到很重要的作用。
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose regulated protein78，GRP78）是1977年被發(fā)現(xiàn)的分子伴侶，它是一種多功能的內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)蛋白。它有兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域:①N末端結(jié)構(gòu)域含有ATPase催化位點(diǎn)，能結(jié)合ATP;②C末端是高度保守的EEVD氨基酸序列。GRP78主要定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[5]。在未激活的細(xì)胞中，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白結(jié)合，使跨膜蛋白處于未激活狀態(tài)。GRP78還能夠促進(jìn)正確折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。GRP78不僅參與細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，也參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　ERP57稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57（Endoplasmic Reticulum protein

5、57），它不僅是一種二硫鍵異構(gòu)酶，也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，可促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)二硫鍵的形成。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣網(wǎng)蛋白CRT和鈣聯(lián)蛋白CNX結(jié)合對(duì)新合成蛋白質(zhì)進(jìn)行重折疊。
　　GSK2606414是特異性PERK抑制劑，分子量是451.44。在朊病毒感染的小鼠模型中，GSK2606414成功的抑制PERK信號(hào)通路并使感染鼠整體水平得到恢復(fù)，使小鼠得到救治。GSK2606414有精準(zhǔn)的激酶選擇性和藥動(dòng)力學(xué)特征為臨床前階段的研究奠定了基礎(chǔ)。在我們

6、的實(shí)驗(yàn)中，我們采用GSK2606414阻斷PERK信號(hào)通路，進(jìn)一步觀察PERK的作用。PERK信號(hào)通路與學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)，PERK激活后引起p-eIF2a的表達(dá)增多，p-eIF2a能夠抑制學(xué)習(xí)記憶蛋白的產(chǎn)生，從而抑制了大鼠的學(xué)習(xí)記憶，因此，我們就猜想PERK信號(hào)通路是否也參與到了PTSD的發(fā)病呢。另外，激活后的PERK作用于其下游的靶分子，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，應(yīng)答ERS。有報(bào)道程，與ATF6和IRE1信號(hào)通路相比，PERK信號(hào)通路對(duì)ER

7、S更為敏感，在抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮著重要的作業(yè)，因此，PERK對(duì)應(yīng)激細(xì)胞的存活與凋亡的起著決定性的作用。
　　研究表明PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的改變，這可能是導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變、體積縮小，引起功能下降的原因，這也與PTSD的發(fā)病有一定關(guān)系。鑒于PERK信號(hào)通路及分子伴侶GRP78，ERP57及CRT在UPR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡上的重要作用，同時(shí)PERK信號(hào)通路參與大腦的學(xué)習(xí)記憶，并且目前沒有關(guān)于mPFC神

8、經(jīng)元PERK信號(hào)通路與PTSD發(fā)病關(guān)系的研究，因此，我們將其作為了研究切入點(diǎn)，來深入探討PTSD大鼠mPFC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK通路應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機(jī)制，來揭示PTSD的部分發(fā)病機(jī)制，也為有效治療PTSD提供新思路。
　　方法：
　　1.采用單一連續(xù)刺激(Single-Prolonged Stress，PTSD-SPS)來構(gòu)建PTSD動(dòng)物模型。
　　2.采用行為學(xué)方法檢測大鼠的行為學(xué)變化，行為學(xué)方法包括Morri

9、s水迷宮測試(Morris Water Maze Test，MWM)，高架十字迷宮(Plus Maze Test)和曠場實(shí)驗(yàn)(Open Field Maze Test)，來驗(yàn)證PTSD-SPS動(dòng)物模型是否成功。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(The Novel object recognization test，NOR)來檢測大鼠的前額皮質(zhì)相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　3.熒光分光光度計(jì)檢測mPFC神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度:取正常對(duì)照組及SPS7

10、d大鼠，經(jīng)麻醉，開顱取mPFC100mg，制備106～107/ml的細(xì)胞懸液后，在細(xì)胞懸液中加入1 mmol/L Fura-2/AM然后把細(xì)胞懸液放置于避光處孵育40min(37℃);孵育完成后利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。
　　4.采用分子生物學(xué)技術(shù)(免疫熒光雙標(biāo)、Western blotting及PCR)檢測正常組，SPS組及GSK2606414給藥組大鼠mPFC PERK信號(hào)通路蛋白及相關(guān)凋亡因子在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)

11、變化;
　　5.采用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及凋亡細(xì)胞的形態(tài);
　　6.采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡;
　　結(jié)果：
　　1.PTSD大鼠行為學(xué)改變
　　Morries水迷宮定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在前5天的定位巡航實(shí)驗(yàn)中SPS大鼠找到水下平臺(tái)所需要游泳的距離明顯多于正常組，在第6天的測試實(shí)驗(yàn)中，SPS大鼠在目標(biāo)象限所花費(fèi)的時(shí)間比明顯低于正

12、常大鼠;
　　高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPS刺激后的大鼠在開放臂的時(shí)間比明顯低于正常組;
　　曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPS刺激后大鼠進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)明顯少于正常組。
　　2.PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元游離鈣水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CRT，GRP78及ERP57的表達(dá)變化
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPS刺激使mPFC神經(jīng)元內(nèi)游離鈣水平明顯增加。同時(shí)，SPS刺激增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CRT，GRP78及ERP57的蛋白和mRNA

13、水平的表達(dá)。
　　3.PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元中PERK信號(hào)通路及相關(guān)凋亡因子變化
　　SPS組大鼠mPFC神經(jīng)元中，PERK，p-PERK，eIF2a，p-eIF2a，ATF4及CHOP的蛋白水平和mRNA水平明顯高于正常對(duì)照組。SPS大鼠mPFC神經(jīng)元中相關(guān)凋亡因子Caspase7/12/3及Bax的蛋白水平表達(dá)明顯高于正常組。
　　4.PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元ER形態(tài)及Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　與正常組

14、大鼠相比，SPS大鼠mPFC神經(jīng)元ER擴(kuò)張，形態(tài)發(fā)生變化。
　　Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，SPS刺激組大鼠mPFC中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。
　　5.GSK2606414藥物對(duì)SPS大鼠的影響
　　1).給藥后，各組大鼠mPFC神經(jīng)元PERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果
　　SPS-GSK2606414組大鼠mPFC神經(jīng)元中p-PERK，p-eIF2a，ATF4及CHOP的蛋白表達(dá)明顯低于SPS-vehi

15、cle組大鼠。
　　2).內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡因子Caspase12及Bax的檢測結(jié)果
　　SPS-GSK2606414組大鼠mPFC神經(jīng)元中caspase12及Bax的表達(dá)明顯低于SPS-vehicle組大鼠。
　　3).Tunel凋亡檢測結(jié)果
　　與SPS-vehicle組大鼠相比，SPS-GSK2606414組大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)明顯降低。
　　4).行為學(xué)檢測結(jié)果
　　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示

16、，SPS-GSK2606414組大鼠花比SPS-vehicle組大鼠更少的路程找到水下平臺(tái)，并且SPS-GSK2606414組大鼠潛伏期較SPS組大鼠短。在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，與SPS-vehicle組大鼠相比，SPS-GSK2606414組大鼠對(duì)新對(duì)象花費(fèi)的時(shí)間比（新事物/舊事物）更高。
　　結(jié)論：
　　1.分子伴侶calreticulin、GRP78及ERP57介導(dǎo)的UPR反應(yīng)參與了PTSD的發(fā)病。
　　2.PTSD