GP73在肝癌細(xì)胞侵襲和遷移過(guò)程中的作用.pdf

1、目的：探討RNA干擾技術(shù)（RNAi）沉默人肝癌細(xì)胞中高爾基體蛋白73(GP73)基因表達(dá)后，對(duì)其侵襲和遷移能力的影響，并探索其相關(guān)機(jī)制，為將該基因應(yīng)用于肝癌的基因靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴根據(jù)GP73序列和 siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成一條靶向 GP73基因的小干擾RNA（siRNA），應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將設(shè)計(jì)合成的GP73 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC7721細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和EL

2、ISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后2株細(xì)胞GP73 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化；⑵按最佳轉(zhuǎn)染條件沉默 GP73基因的表達(dá)后，采用 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察 HepG2和 SMMC7721細(xì)胞侵襲能力改變，采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)以及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分別觀察其縱向和橫向遷移能力改變；⑶qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)侵襲相關(guān)因子及通路蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(

3、Snail)、波形蛋白(Vimentin）的表達(dá)情況，探索沉默GP73基因后影響細(xì)胞侵襲和遷移能力的潛在機(jī)制。
　　結(jié)果：①GP73 siRNA能顯著降低HepG2和SMMC7721細(xì)胞中GP73 mRNA和蛋白的表達(dá)；②GP73 siRNA沉默GP73基因的表達(dá)后，HepG2和SMMC7721細(xì)胞的侵襲和遷移能力均較對(duì)照組明顯降低；③有效沉默 GP73后，qRT-PCR結(jié)果顯示MMP-2、MMP-9、Snail和Vimentin

4、的mRNA表達(dá)水平有所降低，而E-cadherin mRNA表達(dá)水平有所升高；相應(yīng)地，Western blot結(jié)果也顯示MMP-2、MMP-9、Snail和Vimentin的蛋白表達(dá)水平有所降低，但E-cadherin的蛋白表達(dá)水平有所升高。
　　結(jié)論：⑴GP73 siRNA可明顯降低GP73基因在HepG2和SMMC7721細(xì)胞中的表達(dá)水平；⑵GP73 siRNA有效沉默GP73基因表達(dá)后，HepG2和SMMC7721細(xì)胞的侵襲