AMPKα2在二甲雙胍抑制香煙暴露下肺動脈平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)作為慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease，COPD)的重要并發(fā)癥之一，直接影響了COPD患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。吸煙是COPD最主要的危險因素，一系列臨床組織標本和動物模型結(jié)果表明:吸煙COPD患者的早期無低氧階段，甚至在肺功能完全正常的吸煙人群，肺血管重構(gòu)的現(xiàn)象就已經(jīng)開始出現(xiàn)，其機制可能和吸煙致高氧化應(yīng)激狀態(tài)和慢性炎癥有關(guān)

2、。
　　近年來調(diào)控細胞能量代謝平衡的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為調(diào)控機體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要靶點備受關(guān)注。在糖尿病和肥胖患者中，其體內(nèi)AMPK低活性狀態(tài)與該類患者機體高氧化應(yīng)激狀態(tài)和慢性炎癥、心血管合并癥的發(fā)病率密切相關(guān)。AMPK的激活對于維持正常血管的正常結(jié)構(gòu)和功能十分重要。目前關(guān)于AMPK與體循環(huán)疾病，如動脈粥樣硬化和球囊損傷后再狹窄的研究結(jié)果，幾乎得出了一致

3、的結(jié)論——上調(diào)AMPK活性可以保護內(nèi)皮細胞功能，抑制動脈平滑肌細胞增殖。隨著對AMPK研究的深入，逐漸認識到其關(guān)鍵亞型AMPKα1和AMPKα2，似乎在維持血管穩(wěn)態(tài)中所起的作用不盡相同。肺血管重構(gòu)是PH的基本病理特征，其中肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）表型轉(zhuǎn)化——從收縮型（分化）向合成型（未分化）轉(zhuǎn)化是獲得異常增殖/遷移、合成分泌能力，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)和PH形

4、成的前提和基礎(chǔ)。而香煙暴露下所致高氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境是COPD合并PH發(fā)生的基礎(chǔ)，我們推測調(diào)控氧化應(yīng)激和慢性炎癥的靶點——AMPK極有可能在調(diào)控香煙暴露下PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和增殖中發(fā)揮重要作用，有必要對其機制深入探討。
　　傳統(tǒng)降糖藥物二甲雙胍是AMPK的激活劑，動物實驗表明二甲雙胍抑制野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓形成，此項研究雖然未直接探討其機制，但初步證實了二甲雙胍可能對肺循環(huán)具有保護作用。本項目擬探討AMPK及其不同亞型在香

5、煙暴露下PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和過度增殖中的作用;闡明二甲雙胍是否通過激活A(yù)MPK或特定AMPK亞型抑制肺血管重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和過度增殖。在目前COPD相關(guān)肺動脈高壓尚缺乏有效治療手段的背景下，一旦我們的假設(shè)得以驗證，將有助于闡明吸煙致COPD相關(guān)PH的分子機制，并為其早期防治提供新思路。
　　目的:
　　1.研究吸煙、全身炎癥水平與PH之間的關(guān)系;
　　2.明確AMPKα2在香煙提取物(cig

6、arette smoking extract，CSE)誘導(dǎo)的大鼠PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用。
　　3.明確AMPKα2在二甲雙胍抑制香煙暴露下PASMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖中的作用。
　　方法:
　　1.采用病例對照研究設(shè)計，以2013年4月-2015年3月111例入住我科的COPD合并PH患者作為病例組，匹配年齡、性別后以同期111例COPD未合并PH的住院患者作為對照組。采集患者年齡、性別、吸煙史、血沉(ESR)、白

7、細胞(WBC)、中性粒細胞/淋巴細胞比例(NLR)、血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、纖維蛋白原(FIB)、降鈣素原(PCT)、動脈血氣、胸部CT及心臟彩超等結(jié)果。使用SPSS22軟件對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)差異比較，并進行相關(guān)性分析及多因素Logistic回歸分析找出PH的相關(guān)危險因素;
　　2.5％CSE處理體外分離培養(yǎng)大鼠PASMCs，采用CCK-8法檢測細胞增殖，Weste

8、rnblot檢測PASMCs表型標志物(SMA)，AMPK、mTOR表達及其磷酸化水平。采用慢病毒介導(dǎo)的siRNA沉默PASMCs中AMPKα1和AMPKα2基因表達，明確不同亞型AMPKα在CSE誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用;
　　3.觀察二甲雙胍對5％CSE暴露下PASMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響，明確AMPKα2是否在其中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:
　　1.COPD合并PH組的吸煙指數(shù)、血清CRP、IL-6及T

9、NF-α水平均明顯高于COPD未合并PH組(p＜0.05);
　　2.吸煙指數(shù)、血清CRP、IL-6及TNF-α水平與肺動脈收縮壓呈正相關(guān)(p＜0.05)，吸煙指數(shù)與CRP水平也呈正相關(guān)(p＜0.05);
　　3.多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示吸煙指數(shù)、血清CRP、IL-6及TNF-α水平是肺動脈高壓形成的獨立危險因素(OR值分別為6.185、6.740、3.434、2.700，p＜0.05);
　　4.CCK

10、-8結(jié)果顯示5％CSE促進大鼠PASMCs增殖，Western blot結(jié)果顯示5％CSE可以下調(diào)PASMCs收縮表型標志物SMA的表達(p＜0.05);
　　5.采用慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)成功將大鼠PASMCs中的AMPKα1、AMPKα2基因沉默后，Western blot結(jié)果顯示AMPKα2 siRNA組的SMA表達明顯下降(p＜0.05);
　　6.CCK-8結(jié)果顯示二甲雙胍明顯抑制5％CSE促PASMCs的增殖

11、效應(yīng)(p＜0.05);二甲雙胍無法抑制AMPKα1 siRNA組和AMPKα2 siRNA組PASMCs的增殖;
　　7.Western blot結(jié)果顯示二甲雙胍可以逆轉(zhuǎn)5％CSE誘導(dǎo)的SMA表達下調(diào)(p＜0.05);
　　8.Western blot結(jié)果進一步證實二甲雙胍通過激活A(yù)MPKα2/mTOR途徑抑制5％CSE致PASMCs表型轉(zhuǎn)化，維持PASMCs正常表型。
　　結(jié)論:
　　1.吸煙、全身炎癥反應(yīng)（C

12、RP、IL-6、TNF-α水平增加）是肺動脈高壓發(fā)生的獨立危險因素;
　　2.吸煙及血清CRP、IL-6、TNF-α與肺動脈收縮壓呈正相關(guān)，吸煙指數(shù)與血清CRP呈正相關(guān);
　　3.體外實驗證明5％CSE促進大鼠PASMCs增殖，并下調(diào)PASMCs收縮表型標志物SMA的表達，使PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化;
　　4.AMPKα2在CSE誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用;
　　5.二甲雙胍可以逆轉(zhuǎn)5％CSE誘導(dǎo)的