地塞米松對大鼠肌腱干細(xì)胞增殖、分化和遷移的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過選取糖皮質(zhì)激素的一種最具代表藥物地塞米松(dexamethasone，Dex)研究不同濃度Dex對大鼠肌腱干細(xì)胞(rat tendon stem cells，rTSCs)增殖、分化和遷移的影響;闡明Dex抑制rTSCs向肌腱細(xì)胞分化，促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，抑制肌腱干細(xì)胞遷移的機(jī)制，最終闡明糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致肌腱自發(fā)斷裂、肌腱自身修復(fù)能力降低的機(jī)制及針對由此導(dǎo)致的肌腱斷裂尋找治療方案。
　　方法：
　

2、　(1)rTSCs分離、培養(yǎng)以及Dex對rTSCs增殖的影響
　　首先通過I型膠原酶消化和在顯微鏡下挑取克隆的方法對rTSCs進(jìn)行分離，通過流式細(xì)胞鑒定技術(shù)對rTSCs表面標(biāo)志物CD44、CD90以及通過免疫熒光對胞內(nèi)標(biāo)志物Nucleostemin、SSEA-4進(jìn)行鑒定，通過三系誘導(dǎo)對rTSCs成骨、成軟骨、成脂分化能力進(jìn)行鑒定。通過CCK-8法研究不同濃度Dex對rTSCs增殖的影響，進(jìn)一步通過Ki-67法研究1 uM Dex對

3、rTSCs增殖的影響。
　　(2)Dex對rTSCs分化的影響及其機(jī)制研究
　　1)Dex對rTSCs分化的影響
　　首先我們通過HE染色和抗I型膠原免疫組化染色比較了正常的人體跟腱組織和長期使用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致斷裂的跟腱組織，接著我們通過流式細(xì)胞技術(shù)研究了1uMDex對rTSCs中CD44和CD90陽性細(xì)胞比例的影響，qPCR檢測比較了不同濃度Dex對rTSCs成肌腱分化轉(zhuǎn)錄因子Scx和成脂分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα m

4、RNA表達(dá)的影響。通過qPCR和WB檢測成肌腱分化標(biāo)志物Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen，ColⅠ)、tenomodulin(TNMD)和成脂分化標(biāo)志物ap2、CCAAT-enhancer-binding proteinsα(C/EBPα)mRNA的表達(dá)和ColⅠ、ap2、C/EBPα蛋白的表達(dá)，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化、油紅染色和通過免疫熒光染色檢測ColⅠ、ap2來研究Dex對rTSCs分化的影響。
　　2)scleraxi

5、s(Scx)在Dex抑制rTSCs向肌腱細(xì)胞分化的作用
　　首先通過抗Scx免疫組化染色比較了正常人體跟腱組織和因長期使用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致斷裂的跟腱組織Scx表達(dá)的差異，接著通過體外實驗研究Dex對rTSCs表達(dá)Scx的影響以及Dex通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)與Scx基因啟動子上游可能的結(jié)合位點，通過轉(zhuǎn)染Scx過表達(dá)和干擾質(zhì)粒后，通過觀察rTSCs形態(tài)變化以及通過qPCR檢測成肌腱分化

6、標(biāo)志物ColⅠ、TNMD的表達(dá)，研究Scx在Dex抑制rTSCs成肌腱分化中的作用，通過Gene-mapper和ChIP-sequence預(yù)測GR與Scx基因上游2000bp可能的結(jié)合位點，進(jìn)一步通過ChIP-PCR驗證預(yù)測的結(jié)合位點是否為GR與Scx上游DNA片段真正的結(jié)合位點。
　　3)DKK1/GSK-3β/β-catenin在Dex促進(jìn)rTSCs向脂肪細(xì)胞分化的作用
　　Dex作用rTSCs以后，通過qPCR篩選經(jīng)典

7、與非經(jīng)典的WNT信號通路配體，發(fā)現(xiàn)DKK1高表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染DKK1 shRNA干擾質(zhì)粒以及Licl處理后，通過WB檢測P-GSK-3β(ser9)和P-GSK-3β(tyr216)以及活性β-catenin的蛋白變化，分別采用qPCR和WB方法檢測成脂分化標(biāo)志物ap2、C/EBPα mRNA和蛋白的表達(dá)以及通過油紅染色檢測成熟的脂肪細(xì)胞形成研究DKK1/GSK-3β/β-catenin在Dex誘導(dǎo)rTSCs成脂分化中的作用。
　　

8、(3)Dex對rTSCs遷移的影響及其機(jī)制研究
　　1)Dex對rTSCs遷移的影響
　　將1uM Dex作用于rTSCs，采用鬼筆環(huán)肽染色研究了Dex對rTSCs細(xì)胞骨架的影響，通過劃痕實驗、transwell實驗觀察Dex對rTSCs橫向和縱向遷移的影響。
　　2)ROCK1和ROCK2在Dex抑制rTSCs遷移的作用
　　首先通過qPCR和WB研究了Dex對ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，

9、使用ROCKs分了的抑制劑Y-27632以及ROCK2慢病毒干擾作用于rTSCs以后，通過細(xì)胞劃痕實驗和transwell實驗研究ROCK1和ROCK2在Dex抑制rTSCs遷移中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、rTSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物及具有多向分化潛能
　　本課題組從大鼠跟腱分離的P0代肌腱干細(xì)胞呈現(xiàn)鵝卵石樣，通過流式細(xì)胞鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群體中CD44和CD90陽性細(xì)胞數(shù)均超過90％以上，而通過免疫熒光染色檢測

10、SSEA-4和Nucleostemin發(fā)現(xiàn)，SSEA-4在胞漿中表達(dá)，而Nucleostemin在胞核中大量表達(dá)。肌腱干細(xì)胞經(jīng)過成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)誘導(dǎo)21天以后，分別通過茜素紅染色、油紅染色、甲苯胺藍(lán)染色檢測發(fā)現(xiàn)，本課題組分離得到的rTSCs具有向成骨、成脂、成軟骨分化的能力。
　　2、低濃度Dex促進(jìn)rTSCs增殖，高濃度Dex抑制rTSCs增殖
　　使用0nM、1nM、10nnM、100nM、1uM Dex處理rTS

11、Cs6h、12h、24h、48h，通過CCK-8試劑處理檢測發(fā)現(xiàn)，10nM Dex促進(jìn)rTSCs增殖，1uM Dex抑制rTSCs增殖。12h、24h、48h后，1nM、10nM Dex促進(jìn)rTSCs增殖，而100nM、1uM抑制rTSCs增殖。通過抗Ki-67免疫熒光染色檢測進(jìn)一步證實1uM Dex抑制rTSCs增殖。
　　3、Dex抑制rTSCs向肌腱細(xì)胞分化，促進(jìn)其向脂肪細(xì)胞分化
　　HE染色和抗Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)

12、果顯示正常跟腱組織膠原纖維排列整齊、緊密，I型膠原高表達(dá)，而糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致斷裂的跟腱組織中膠原纖維素排列紊亂、疏松，其間有類似脂肪組織化生，Ⅰ型膠原表達(dá)量降低。正常培養(yǎng)和Dex作用3天以后，CD44和CD90陽性細(xì)胞比例均較3天前顯著降低，Dex組較正常培養(yǎng)組CD44和CD90陽性細(xì)胞比例顯著降低。
　　4、Dex通過Scx抑制rTSCs向肌腱細(xì)胞分化
　　將1uM Dex作用rTSCs1、3、5、7天，Scx表達(dá)顯著降低，

13、而采用GR拮抗劑Mi處理以后，Mi能拮抗Dex誘導(dǎo)的Scx表達(dá)降低。作用7天后，Dex從蛋白水平抑制Scx表達(dá)，Mi能拮抗Dex誘導(dǎo)的Scx表達(dá)降低。說明Dex通過與GR結(jié)合抑制Scx表達(dá)。
　　5、Dex通過DKK1/GSK-3β/β-catenin促進(jìn)rTSCs向脂肪細(xì)胞分化
　　將1uM Dex作用rTSCs3、5、7、14天，通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Dex組較對照組上調(diào)DKK1的表達(dá)，而通過WB檢測發(fā)現(xiàn)Dex也從翻譯水

14、平上調(diào)DKK1的表達(dá)。
　　6、Dex抑制rTSCs遷移
　　將1 uM Dex作用rTSCs24h后，通過細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞transwell實驗發(fā)現(xiàn)，Dex顯著抑制rTSCs遷移，同時我們發(fā)現(xiàn)Dex作用rTSCs1、3、5、7天，通過qPCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)，Dex組較對照組顯著升高ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白的表達(dá)，不改變RhoA的表達(dá)。
　　7、ROCKs在Dex抑制rTSCs遷移的作用
　　通過

15、劃痕實驗和transwell遷移實驗研究了Dex與Y27632對rTSCs遷移的影響，劃痕12h、24h后，分別在顯微鏡下結(jié)果顯示:Y27632加快rTSCs的側(cè)向遷移，減弱Dex對rTSCs側(cè)向遷移的抑制作用。將小室放在24孔板24h后，通過結(jié)晶紫染色在顯微鏡下結(jié)果顯示:Y27632加快rTSCs的縱向遷移，減弱Dex對rTSCs縱向遷移的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗以酶消化法成功分離獲得了rTSCs，獲得的細(xì)胞

16、形態(tài)和免疫表型及多向分化能力符合MSCs的表型特征。本研究結(jié)果提示低濃度(1nM、10nM)Dex顯著促進(jìn)rTSCs增殖，而高濃度(100nM、1uM)Dex顯著抑制rTSCs增殖。
　　2、本實驗證實低濃度Dex促進(jìn)rTSCs成肌腱分化的轉(zhuǎn)錄因子Scx表達(dá)，抑制成脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的表達(dá)，而高濃度Dex抑制rTSCs表達(dá)Scx，促進(jìn)其其表達(dá)C/EBPα。高濃度Dex作用于受體以后，受體與成肌腱分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sc

17、x的啟動子上游-726～-734堿基GGCAAGGT結(jié)合，抑制其表達(dá)，從而抑制rTSCs向肌腱細(xì)胞分化。我們的結(jié)果證實Dex誘導(dǎo)的rTSCs向脂肪細(xì)胞分化是由DKK1/GSK-3β/β-catenin介導(dǎo)的。DKK1的下調(diào)或者GSK-3β抑制劑是拮抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的靶點。
　　3、本實驗證實Dex改變rTSCs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，抑制rTSCs橫向和縱向遷移。本實驗證實Dex通過上調(diào)ROCKs抑制rTSCs遷移，