Porf-2調控神經干細胞增殖、分化的分子機制及對視神經損傷后視覺誘發(fā)電位的影響.pdf

1、研究背景:
　　視前區(qū)前調控因子2（Preoptic regulatory factor-2，Porf-2）是在中樞神經系統中發(fā)現的一類生長調控因子。Porf-2蛋白自1990年在大鼠下丘腦視前區(qū)中被發(fā)現以來，其功能一直被忽視，僅有少量研究報道其在生殖-內分泌系統中存在表達，與生長發(fā)育密切相關，而其在中樞神經系統中的功能罕有報道。近年來，Porf-2在中樞神經系統中的功能開始引起神經科學界的重視。2011年，被報道Porf-2可以

2、影響神經干細胞（neural stem cells，NSCs）的增殖與凋亡。然而，該研究使用的是Porf-2的短肽段（75個氨基酸），無法準確反映Porf-2的功能，且缺乏深入的機制研究。此外，Porf-2的全長對原代NSCs的增殖及分化的影響目前國內外尚未見報道。
　　研究目的:
　　1.探討Porf-2影響NSCs增殖、分化的分子機制。
　　2.探討視神經損傷環(huán)境下Porf-2對NSCs增殖、分化及視覺誘發(fā)電位的影

3、響。
　　研究方法:
　　1．NSCs培養(yǎng)與鑒定選取孕14天的胚胎大鼠海馬組織，分離出NSCs，行傳代培養(yǎng)，Nestin、Porf-2鑒定及形態(tài)觀察。NSCs無血清分化培養(yǎng)+貼壁培養(yǎng)的方法誘導分化，免疫熒光細胞化學法檢測神經元標志物β-tubulinIII和神經膠質細胞標志物GFAP的表達情況。
　　2．病毒構建采用基因工程技術將大鼠Porf-2基因插入慢病毒過表達載體pLenti-Ubc-EGFP-3FLAG，插入P

4、orf-2基因干擾序列構建Porf-2基因沉默載體pHBLV-Porf-2siRNA-U6-Zsgreen，包裝重組質粒。XhoI和BamHI雙酶切測序分析鑒定插入片段的正確性。通過重組慢病毒載體包裝系統共轉染293T細胞包裝病毒，并測定病毒滴度。
　　3．慢病毒轉染及相關因子分析使用分別構建的沉默、過表達慢病毒轉染NSCs；采用免疫熒光法對轉染后的NSCs進行Nestin鑒定以及分化方向鑒定；采用免疫共沉淀技術檢測Porf-2與

5、Rac1的結合。使用GST-pull down技術分析Porf-2沉默、過表達狀態(tài)下對Rac1活性的影響。采用real-time PCR和Western Blot檢測Porf-2、Wnt3a、β-catenin、Wif-1、Dkk-1、Wnt-1、Wnt-3、Dishevelled、Frizzled-1、Frizzled-5、 LRP-5、LRP-6、Axin、APC及GSK-3βmRNA和蛋白的表達水平。
　　4．Porf-2對

6、NSCs增殖、分化的影響分別在轉染后第1、2、3、4、5、6、7、10、14d使用CCK8法檢測NSCs增殖；轉染后7天，使用Wnt3a蛋白孵育轉染細胞，觀察細胞增殖情況。使用EdU實驗檢測轉染后NSCs中 EdU+細胞比例；分別使用Rac1抑制劑、激動劑，Wnt抑制劑、激動劑通過CCK8、EdU法評估細胞增殖情況。免疫熒光染色檢測向β-tubulinIII及GFAP標記細胞的分化。
　　5．大鼠標準化視神經損傷模型建立與視網膜下

7、腔定點注射：使用我們已建立的大鼠標準化視神經損傷模型，使用夾閉力為90g的Yasargil動脈瘤夾鉗夾視神經9s致傷。
　　6．Wnt3a蛋白的檢測:分別在視網膜下腔注射后7d、14d取出眼球并完整分離出視網膜組織。使用Western Blot法檢測損傷組及正常組大鼠視網膜組織中的Wnt3a蛋白的表達量。
　　7．移植細胞增殖能力檢測:用微量注射器分別向大鼠視神經損傷側視網膜下腔注射2μl Porf-2-overexpres

8、sion-NSCs（1×105個/μl）懸液、Porf-2-knockdown-NSCs懸液（1×105個/μl）和GFP-NSCs懸液（1×105個/μl）。視網膜下腔注射后2周處死動物，行視網膜冰凍切片。采用免疫組化方法檢測移植細胞在宿主視網膜增殖情況，比較 BrdU指數。在視網膜下腔注射后第8周，采用視覺誘發(fā)電位技術檢測視覺功能，然后處死動物，行視網膜冰凍切片，采用免疫組化方法檢測移植細胞向神經元或神經膠質細胞分化的比例。

9、　　研究結果：
　　1.成功從胎鼠海馬組織分離、培養(yǎng)NSCs，誘導分化為β-tubulinIII陽性的神經元和GFAP陽性細胞的星形膠質細胞。
　　2.成功構建Porf-2沉默或過表達慢病毒載體（pLenti-Porf-2-Ubc-EGFP-3FLAG、pHBLV-Porf-2siRNA-U6-Zsgreen）經限制性內切酶檢測、基因測序及綠色熒光檢測證實攜帶Porf-2基因的重組慢病毒構建成功，滴度大于2×108 TU/m

10、l。
　　3.轉染后NSCs在熒光顯微鏡下呈綠色，Nestin表達陽性；誘導分化后可見β-tubulinIII陽性和GFAP陽性細胞；免疫共沉淀結果顯示Porf-2與Rac1存在結合，且Porf-2基因沉默可以提高Rac1的活性，Porf-2過表達可以降低Rac1的活性。Wif-1、Dkk-1、Wnt-1、Wnt-3、Dishevelled、Frizzled-1、Frizzled-5、LRP-5、LRP-6、β-catenin、A

11、xin、APC和GSK-3β在沉默、過表達組均未見明顯變化（p>0.05）。Porf-2基因沉默組LEF-1、TCF和cyclin D1表達升高，p21表達降低；過表達組結果則相反，兩組間存在差異（p<0.05）。
　　4. CCK8檢測結果顯示轉染后4d，5d，6d，7d、10d、14d，Porf-2基因沉默組的吸光度值明顯高于對照組及過表達組（p<0.05）。沉默組的EdU陽性細胞比例也明顯高于對照組及過表達組（p<0.05）

12、。在Porf-2沉默組，使用Rac1抑制劑、Wnt抑制劑可以逆轉Porf-2基因沉默的促增殖效果。而在Porf-2過表達組，使用Rac1激動劑、Wnt激動劑可以逆轉Porf-2過表達的抑制增殖效應。血清誘導分化 NSCs行免疫熒光檢測，Porf-2-overexpression-NSCs、Porf-2-knockdown-NSCs組和GFP-NSCs組之間向神經元、星形膠質細胞的分化比例，組間比較無差異（p>0.05）。
　　5.

13、大鼠視神經損傷后，其視網膜組織中Porf-2蛋白的表達較正常對照組明顯升高（P<0.05）。
　　6. Porf-2-knockdown-NSCs組的EdU指數高于Porf-2-overexpression-NSCs和GFP-NSCs組（P<0.05）。
　　7.移植后第8周，移植細胞行免疫熒光檢測，Porf-2-overexpression-NSCs、Porf-2-knockdown-NSCs組和GFP-NSCs組之間向神

14、經元、星形膠質細胞的分化比例，組間比較無差異（p>0.05）。
　　8. Porf-2-knockdown-NSCs組 P1波幅高于GFP-NSCs組及 Porf-2-overexpression-NSCs組，而Porf-2-overexpression-NSCs組P1波幅較低，兩組間存在差異（p<0.05）。Porf-2-knockdown-NSCs組P1峰潛時短于GFP-NSCs組及Porf-2-overexpression-

15、NSCs組，而Porf-2-overexpression-NSCs組P1波幅較長，兩組間存在統計學顯著性差異（p<0.05）。
　　研究結論:
　　1. Porf-2基因沉默能夠促進體外NSCs的增殖，Porf-2基因過表達則抑制體外NSCs的增殖。但Porf-2對體外NSCs向神經元、星形膠質細胞分化的比例影響不顯著。
　　3. Porf-2降低Rac1活性，抑制Wnt信號通路關鍵分子--β-catenin的入核過程