中性粒細胞彈性蛋白酶對白血病細胞作用及其相應機制的研究.pdf

1、本文對中性粒細胞彈性蛋白酶對白血病細胞作用及其相應機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：重組慢病毒LV5-NE的構建及其在NB4細胞中的篩選。
　　目的：構建表達NE的慢病毒載體，在急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4細胞中過表達NE,并篩選純的表達NE的NB4細胞株。
　　方法：以質粒pCMV-myc-NE為模板得到PCR產物NE的CDS區(qū)，將NE基因連接到穿梭載體pGLV10/U6/GFP/Puro后酶切

2、驗證，將序列正確的含NE質粒與包裝質粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）同時轉染293T細胞。測定病毒滴度。實驗分為空白對照組、NB4/LV5-NC組和NB4/LV5-NE組，熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。慢病毒感染NB4細胞72小時后加入終濃度1μ g/mL的嘌呤霉素（puromycin，PM）進行篩選；3天后減少PM的濃度至0.5μ g/mL，并維持此濃度繼續(xù)培養(yǎng)1周。RT-PCR和qRT-PCR鑒定NB4細胞中NE的表

3、達；western-blot進一步鑒定NE是否表達。
　　結果：酶切鑒定及測序結果表明成功構建重組穿梭質粒LV5-NE，同源重組成功，得到重組子LV5-NE；熒光顯微鏡顯示病毒包裝成功；經過五輪擴增后，病毒滴度達到3.0×108。慢病毒感染NB4細胞后，用PM進行篩選得到純的NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE細胞；RT-PCR和qRT-PCR檢測到NE在NB4細胞中表達（P<0.05）；western-blot檢測到NE蛋

4、白在NB4細胞中表達（P<0.05）。
　　結論：成功構建了攜NE的慢病毒載體LV5-NE，并成功感染NB4細胞，篩選得到NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE細胞。
　　第二部分：LV5-NE對NB4細胞增殖、凋亡和PI3K/Akt的影響。
　　目的：探討NE對人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4生物學效應和PI3K/Akt的影響，尋找NE致白血病的可能機制。
　　方法：實驗分為空白對照組、LV5-NC組和L

5、V5-NE組。慢病毒感染NB4細胞后，qRT-PCR檢測基因NE的表達；Western blot檢測蛋白NE的表達；CCK-8法觀察NB4細胞增殖能力；流式細胞儀測定NB4細胞周期和凋亡；qRT-PCR檢測CCD1、FOX1、mTOR、RICTOR和PTEN基因表達；Western blot檢測pAkt、Akt、Bax和Bcl-2蛋白表達。
　　結果：在NB4細胞中過表達NE后與空白對照組和LV5-NC組相比：CCK-8提示NE明

6、顯促進NB4細胞的增殖作用（P<0.05）；流式細胞術顯示NB4細胞周期阻滯在S期和G2期（P<0.05），NB4細胞凋亡減少（P<0.05）；qRT-PCR顯示基因 CCD1和 FOX1表達上調,基因 mTOR、RICTOR和PTEN下調（P<0.05）；Western blot顯示pAkt和Bcl-2表達增多（P<0.05）。
　　結論：NE在NB4細胞株中過表達后可促進NB4細胞的增殖抑制其凋亡，這一效應可能與PI3K/Ak

7、t通路中的基因和蛋白改變有關。
　　第三部分：NE對U937細胞中PI3K/Akt的影響。
　　目的：探討在U937細胞中干擾NE后對細胞PI3K/Akt通路的影響。
　　方法：siRNA-NE在脂質體2000的輔助下轉染U937細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效率；qRT-PCR檢測基因NE表達是否下調；western-blot檢測蛋白NE表達是否下調；qRT-PCR檢測細胞CCD1、FOX1、mTOR、RICTOR和PTE

8、N基因表達； western-blot檢測pAkt、Bcl-2和Bax蛋白表達情況。
　　結果：熒光顯微鏡觀察到 siRNA-NE的轉染效率達到95％以上；qRT-PCR結果顯示基因NE表達下調（P<0.05）；western-blot結果表明NE表達明顯下調（P<0.05）；qRT-PCR結果顯示細胞基因CCD1和FOX1表達下調,基因mTOR、RICTOR和PTEN上調（P<0.05）；western-blot結果顯示磷酸化蛋