NOV的差異表達對人骨肉瘤細胞系增殖、凋亡和遷移的影響及機制研究.pdf

1、目的：檢測人骨肉瘤細胞系中腎母細胞瘤過表達（ nephroblastoma overexpressed，NOV）基因的表達水平；采用腺病毒介導(dǎo)的基因過表達或干擾技術(shù)探討NOV對人骨肉瘤細胞株143B和MG63增殖、凋亡和遷移等作用的影響，并對其作用的分子機制進行初步研究。
　　方法：⑴人骨肉瘤細胞系中NOV的表達水平檢測：以本實驗室保存的4種人骨肉瘤細胞株（143B、U2OS、MG63和SaOS2）為研究對象，分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄

2、聚合酶鏈反應(yīng)（ reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測各細胞中NOV的表達水平，從而確定不同類型人骨肉瘤細胞的差異表達。⑵重組腺病毒的感染效率驗證：攜帶人NOV過表達基因的重組腺病毒Ad-NOV及其空載體陰性對照Ad-GFP和表達針對人NOV的siRNA的重組腺病毒Ad-siNOV及其陰性對照Ad-RFP分別用于感染對應(yīng)的

3、低表達和高表達NOV的人骨肉瘤細胞株，熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率，并通過RT-PCR和Western blot驗證NOV在mRNA和蛋白水平的表達或干擾效果。⑶NOV的差異表達對人骨肉瘤143B和MG63細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響：143B和MG63細胞經(jīng)病毒處理相應(yīng)時間后，采用MTT法、克隆形成實驗和流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞增殖能力的改變；Hochest33258染色和FCM用于檢測細胞的凋亡水平；通過劃痕實驗和Transw

4、ell小室法檢測對細胞遷移及侵襲能力的影響。此外，進一步采用RT-PCR和Western blot檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax以及與遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinase， MMP）家族的表達變化，以反映細胞的凋亡和遷移能力改變。⑷NOV的差異表達對人骨肉瘤143B和MG63細胞中信號通路的影響：病毒處理143B和MG63細胞48 h后，采用RT-PCR和Western blot檢測

5、整合素受體家族的表達；熒光素酶報告質(zhì)粒檢測異?；罨男盘柗肿?，Western blot檢測PI3K/Akt、MAPK及下游AP-1等相關(guān)蛋白的磷酸化水平，從而明確NOV作用于人骨肉瘤細胞的信號通路。⑸MAPK信號通路在NOV誘導(dǎo)的骨肉瘤143B細胞增殖、凋亡和遷移中的作用：應(yīng)用MAPK/p38的抑制劑SB203580和MAPK/JNK的抑制劑SP600125分別處理143B細胞，Western blot檢測p-p38和p-JNK的表達水

6、平，驗證抑制劑的效率；細胞經(jīng)抑制劑處理相應(yīng)時間后，采用MTT法檢測細胞活力，Transwell小室法檢測細胞遷移能力的變化，并通過Western blot檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達的改變。
　　結(jié)果：①4株骨肉瘤細胞株經(jīng)RT-PCR檢測后結(jié)果顯示，NOV的表達存在明顯的差異，其中在143B細胞中的表達水平最低，在SaOS2和U2OS細胞中有一定程度的表達，而在MG63細胞中表達水平為最高。Western blot

7、結(jié)果得到的NOV蛋白表達水平與mRNA結(jié)論基本一致。②143B和MG63細胞經(jīng)相對應(yīng)的腺病毒感染24-36 h后，熒光顯微鏡下可見細胞中綠色和紅色熒光蛋白表達有所增強，鏡下判斷腺病毒在細胞中的感染效率達到60-70％。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示143B細胞中Ad-NOV組的NOV的表達明顯高于Ad-GFP組(p＜0.01)和空白對照組(p＜0.05)；MG63細胞中Ad-siNOV組的NOV灰度值則顯著低于Ad-RF

8、P組和空白對照組(p＜0.05)。結(jié)果提示NOV在mRNA和蛋白水平均被成功過表達或干擾。③增殖能力相關(guān)檢測結(jié)果顯示，143B細胞中Ad-NOV組的細胞增殖能力在48 h受到了抑制(p＜0.05)，并且該抑制作用在72 h表現(xiàn)的更為顯著(p＜0.01)；克隆形成實驗結(jié)果亦有類似的發(fā)現(xiàn)，Ad-NOV組的細胞克隆形成能力比對照組降低了23%(p＜0.01)；FCM結(jié)果證實NOV的過表達導(dǎo)致了143B細胞的周期阻滯。與之相反，在MG63細胞中

9、，一系列實驗結(jié)果顯示Ad-siNOV組中細胞的增殖能力(p＜0.01)，克隆形成能力(p＜0.05)都有所增強，對于細胞周期也有一定程度的促進。凋亡水平相關(guān)檢測結(jié)果顯示，143B細胞經(jīng)Ad-NOV處理48 h后發(fā)生早期凋亡的細胞所占比例顯著高于Ad-GFP對照組(p＜0.01)，細胞核染色質(zhì)經(jīng) hochest33258染色也表現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象。同時， RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示Ad-NOV組細胞促凋亡因子Bax表達

10、上調(diào)(p＜0.01)，抗凋亡因子Bcl-2表達下降(p＜0.05)。反之在MG63細胞中，經(jīng)Ad-siNOV處理后發(fā)生凋亡的細胞數(shù)目減少(p＜0.05)，細胞核染色質(zhì)的聚集程度減弱，Bax和Bcl-2的表達水平也表現(xiàn)出與143B細胞中相反的現(xiàn)象。劃痕實驗和Transwell分析顯示，Ad-NOV感染后的143B細胞遷移能力明顯增強，細胞的穿膜數(shù)目相對于對照組有所上升；RT-RCR結(jié)果進一步顯示遷移促進因子MMP蛋白家族的表達在Ad-NO

11、V組細胞中增強。而Ad-siNOV感染后MG63細胞的表現(xiàn)與上述內(nèi)容恰恰相反。④RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在Ad-NOV感染的143B細胞中，整合素受體αv和β3的mRNA和蛋白表達水平都有上調(diào)；熒光素酶報告基因檢測結(jié)果提示細胞中AP-1和NF-κB信號分子異常活化。此外，p38和JNK的磷酸化水平在Ad-NOV組細胞中均有明顯上調(diào)，而p-Akt則無改變。在Ad-siNOV感染的MG63細胞中，無論是整合素受體還是

12、信號分子的磷酸化水平都表現(xiàn)為下降趨勢。⑤使用MAPK/p38的抑制劑SB203580和MAPK/JNK的抑制劑SP600125分別處理143B細胞后，Western blot結(jié)果顯示細胞中p-p38和p-JNK的表達水平相比Ad-NOV組均有下調(diào)，提示SB203580和SP600125有效抑制了143B細胞中由于 NOV過表達而激活的MAPK/p38和MAPK/JNK信號通路。MTT結(jié)果顯示經(jīng)抑制劑作用后的143B細胞增殖能力減弱，低于

13、未經(jīng)抑制劑作用的Ad-NOV組；Transwell分析提示SB203580和SP600125能夠部分抑制NOV過表達誘導(dǎo)的細胞遷移。Western blot結(jié)果顯示使用抑制劑后，Ad-NOV組細胞中Bax表達的上調(diào)趨勢被削弱，而Bcl-2的表達則有所恢復(fù)，進一步證實細胞凋亡水平被抑制。
　　結(jié)論：⑴4種人骨肉瘤細胞株中NOV的表達水平存在明顯的差異。⑵NOV的過表達能夠抑制人骨肉瘤細胞的增殖能力，而在一定程度上促進細胞的凋亡和遷移