集落刺激因子-1受體在鼻咽癌細胞放射抵抗中的作用的初步探討.pdf

1、背景及目的:本課題組通過前期DNA芯片對鼻咽癌放療抵抗型病人和放療敏感型病人組織進行基因表達譜比較，其中差異倍數(shù)最大的是集落刺激因子-1受體(Colony stimulaiting factor1 receptor，CSF-1R)，它在放療抵抗型病人組織中上調(diào)表達，在放療敏感型病人組織中下調(diào)表達，其可能是放療抵抗的一個關(guān)鍵分子，但CSF-1R在鼻咽癌放療抵抗中的機制尚不明確。本課題組在對臨床標本實驗的探究以及免疫組織化學方法分析CSF-

2、1R在鼻咽癌和鼻咽炎中的差異表達的基礎(chǔ)上，利用實時熒光定量PCR(Real-TimeQuantitative Polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western Blot從鼻咽癌細胞株5-8F、6-10B和CNE-2中篩選出CSF-1R高表達(CSF-1R+)細胞株5-8F和CSF-1R低表達（CSF-1R-）細胞株6-10B。進一步進行體外實驗從細胞實驗層面探討鼻咽癌CSF-1R+細胞株和CSF-1R-

3、細胞株之間以及在接受X線照射前后增殖能力和凋亡情況的變化。以期尋找鼻咽癌患者的治療新靶點，同時能為鼻咽癌的治療及預(yù)后找到一個新的預(yù)測指標。
　　方法:
　　1.采用6-MV X線直線加速器按0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的劑量分為5組，分別照射CSF-1 R+細胞株5-8F和CSF-1R-細胞株6-10B，照射后分別繼續(xù)培養(yǎng)各組細胞。
　　2.采用CCK-8法來檢測CSF-1R+細胞株5-8F和CSF-1R-細

4、胞株6-10B的增殖能力，以及檢測接受不同劑量照射前后的5-8F細胞株和6-10B細胞株的增殖能力之間的差異。
　　3.采用克隆形成實驗檢測CSF-1R+細胞株5-8F和CSF-1R-細胞株6-10B的增殖能力，以及檢測接受不同照射劑量前后的5-8F細胞株和6-10B細胞株的增殖能力的差異。
　　4.采用流式細胞術(shù)檢測CSF-1R+細胞株5-8F和CSF-1R-細胞株6-10B的凋亡情況，以及檢測接受不同照射劑量前后的5-8

5、F細胞株和6-10B細胞株的凋亡之間的差異。
　　5.采用RT-PCR檢測CSF-1R+細胞株5-8F和CSF-1R-細胞株6-10B，以及檢測接受不同照射劑量前后的5-8F細胞株和6-10B細胞株的P53，F(xiàn)asL的表達水平。
　　6.通過RNA過表達技術(shù)構(gòu)建6-10B細胞株CSF-1R過表達慢病毒載體。
　　結(jié)果:
　　1.體外實驗分別檢測5-8F細胞株(CSF-1R+)和6-10B細胞株(CSF-1R-)細

6、胞增殖、凋亡能力的差異:
　　1.1 CCK-8增殖實驗表明細胞株5-8F增殖能力高于細胞株6-10B(P＜0.05)
　　1.2 克隆形成實驗表明細胞株5-8F增殖能力高于細胞株6-10B(P＜0.05)
　　1.3 流式細胞術(shù)檢測凋亡情況，表明兩種細胞的凋亡是有差異的，5-8F細胞的凋亡高于6-10B細胞，差異明顯。
　　2.體外實驗檢測接受X線照射后5-8F細胞株(CSF-1R+)和6-10B細胞株(CSF

7、-1R-)（收集不同劑量點和不同時間點的細胞）增殖、凋亡能力的變化:
　　2.1 CCK-8實驗表明:和陰性對照組比較，在培養(yǎng)36小時后，2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后的5-8F細胞增殖情況存在顯著差異（F=1.639，P＜0.01），6-10B細胞株2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后增殖情況存在差異，但差異比5-8F小(F=0.928，P＜0.05)。和陰性對照組比較，在培養(yǎng)48小時后，2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后的5-8F

8、細胞增殖情況存在顯著差異（F=1.548，P＜0.01），6-10B細胞株2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后增殖情況存在明顯差異，(F=9.622，P＜0.01)。
　　2.2 克隆形成實驗結(jié)果表明:各組均有細胞集落形成，但數(shù)目和大小均存在差異，實驗結(jié)果顯示細胞株5-8F的克隆計數(shù)要比細胞株6-10B的克隆計數(shù)要高(P＜0.05)。集落的數(shù)目和X線照射的劑量成反比。
　　2.3 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明:5-8F細胞株凋亡高于6

9、-10B細胞株。
　　3.采用RT-PCR從基因水平檢測CSF-1R+細胞株5-8F和CSF-1R-細胞株6-10B增殖和凋亡相關(guān)因子的表達情況:
　　3.1 增殖相關(guān)因子P53在CSF-1R+細胞株5-8F和CSF-1R-細胞株6-10B中的表達未見明顯差異(P＞0.05);
　　3.2 凋亡相關(guān)因子FasL在5-8F細胞株(CSF-1R+)和6-10B細胞株(CSF-1R-)中的表達并未見明顯差異(P＞0.05);

10、
　　3.3 在細胞接受2Gy X射線照射后，增殖相關(guān)因子P53的mRNA表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但細胞株5-8F細胞P53表達增高大于6-10B細胞株;
　　3.4 細胞株5-8F接受X線照射2Gy和未接受X線照射的FasL的mRNA的表達水平之間存在差異，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);細胞株6-10B接受X線照射2Gy和未接受X線照射中FasL的mRNA的表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.0

11、5);接受2Gy照射的5-8F細胞株中FasL的mRNA的表達水平低于和6-10B細胞株，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。這表明，接受2Gy照射后5-8F的FasL表達水平的降低高于6-10B，CSF-1R的表達和細胞的放射抵抗性是呈正相關(guān)的。
　　4.成功構(gòu)建CSF-1R過表達的慢病毒載體。用于下一步研究CSF-1R陰性細胞株轉(zhuǎn)染CSF-1R過表達慢病毒載體后細胞功能的變化。
　　結(jié)論:
　　1.不同鼻咽癌細胞株的