對硫磷化學(xué)發(fā)光免疫分析方法研究.pdf

1、化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)樣品的微量和痕量檢測、簡便快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)獸藥殘留等檢測。由于對硫磷具有高毒性，對人體造成神經(jīng)性損害，已被禁止應(yīng)用到農(nóng)業(yè)中，但發(fā)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中仍有對硫磷違法噴施，因此被國家列為重點(diǎn)檢測對象。為了防止對硫磷被應(yīng)用到農(nóng)產(chǎn)品中，建立快速、高效、高通量的檢測的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，檢測

2、農(nóng)藥殘留具有重要的意義。主要研究結(jié)果如下:
　　1.本文主要對化學(xué)發(fā)光免疫分析中常用的辣根過氧化物酶標(biāo)記的發(fā)光體系(HRP-Luminol-H2O2)和堿性磷酸酯酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光體系(ALP-AMPPD)進(jìn)行研究，分別對這兩種體系的靈敏度、穩(wěn)定性、檢測限、線性范圍等指標(biāo)進(jìn)行衡量。建立了應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中對硫磷殘留檢測的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。首先采用方陣法，根據(jù)RLUmax/IC50值來確定HRP-Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系和

3、ALP-AMPPD化學(xué)發(fā)光體系的酶標(biāo)半抗原和抗體最適工作濃度，RLUmax/IC50比值越大，化學(xué)發(fā)光免疫分析的工作濃度越適宜。HRP-Luminol-H2O2體系的最適抗體濃度為5μg/L，酶標(biāo)半抗原的濃度為3μg/L; ALP-AMPPD化學(xué)發(fā)光體系的最適抗體濃度為3μg/L，酶標(biāo)半抗原的濃度為1.5μg/L?；谧钸m工作濃度，分別比較HRP-Luminol-H2O2體系和ALP-AMPPD體系CLEIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性，靈敏度、

4、檢測限等。通過研究發(fā)現(xiàn)HRP-Luminol-H2O2發(fā)光體系的靈敏度為5.71μg/kg，檢測限為0.16μg/kg，線性方程y=11.15ln(x)+30.60(RSD＜15％，R2=0.980)。線性范圍0.16-206.88μg/kg; ALP-AMPPD發(fā)光體系的靈敏度為6.22μg/kg，檢測限為0.26μg/kg，線性方程為y=12.54ln(x)+27.07(RSD＜16.77，R2=0.909)，線性范圍0.26-15

5、1.18μg/kg。對比兩種發(fā)光體系的靈敏度、檢測限、穩(wěn)定性以及相關(guān)性可知，HRP-Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系更適用于化學(xué)發(fā)光免疫分析農(nóng)產(chǎn)品中對硫磷殘留檢測分析。
　　2.基于化學(xué)發(fā)光體系的研究，本文選用HRP-Luninol-H2O2作為研究體系，研究該體系的增敏液的增強(qiáng)規(guī)律。選用研究最多增強(qiáng)效果最佳的對碘苯酚(PIP)作為增敏液的增強(qiáng)劑，研究有機(jī)溶劑DMF含量、HRP濃度、魯米諾(Luminol)濃度、增強(qiáng)劑濃度、H

6、2O2濃度對化學(xué)發(fā)光免疫分析的動力曲線的穩(wěn)定性以及發(fā)光強(qiáng)度的影響。研究表明，當(dāng)DMF含量為10％時，HRP濃度為20μg/L、魯米諾濃度為1 mmol、PIP的濃度為0.5 mmol、H2O2的濃度為2 mmol時化學(xué)發(fā)光動力曲線的發(fā)光平臺期的穩(wěn)定時間可持續(xù)18min，發(fā)光強(qiáng)度提高一個數(shù)量級。另外，在本文中PIP分別與4-(1-基-咪唑)-苯酚（4-IMP）、對溴苯酚(BIP)、二碘苯酚(DIOP)和對羥基苯酚(HIOP)共同使用在增敏

7、液體系中，探究PIP與其它物質(zhì)的共同增強(qiáng)效果。當(dāng)PIP分別與4-IMP共同使用時，發(fā)光速率增大，但發(fā)光強(qiáng)度略有降低，發(fā)光平臺期的穩(wěn)定時間為5 min;當(dāng)PIP與BIP共同使用時，發(fā)光速率稍微增大，但發(fā)光強(qiáng)度降低，發(fā)光平臺期的穩(wěn)定時間7min;當(dāng)PIP與DIOP共同使用時，發(fā)光強(qiáng)度提高一個數(shù)量級，發(fā)光平臺期的穩(wěn)定時間為10min，相比單一使用增強(qiáng)劑PIP，DIOP有協(xié)同PIP增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度作用，但是發(fā)光平臺期的穩(wěn)定時間并沒有延長;PIP與H

8、IOP共同使用時，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)至2.3×106，平臺期的穩(wěn)定時間為25 min。綜合以上可知，PIP與HIOP共同使用時，二者在增敏液中有協(xié)同增強(qiáng)的作用。
　　3.在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，樣品的檢測往往受樣品的基質(zhì)效應(yīng)的干擾很大。在本文中通過合成有特異性吸附性的對硫磷分子印跡材料（molecularly imprinted polymers: MIPs），并用在樣品的前處理過程中，降低樣品（蘋果、柑橘、大米和卷心菜）的基質(zhì)干擾效

9、應(yīng)。把PSA和C18作為凈化劑時用在樣品的前處理中，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation:RSD）為3.96％-21.63％，樣品的的回收率為59.10％-126.51％。當(dāng)用分子印跡材料用在前處理中，方法的RSD:3.74％-18.14％，樣品的回收率為72.62％-121.89％。對比兩種前處理程序，當(dāng)分子印跡材料用在前處理過程中，其化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的穩(wěn)定性，準(zhǔn)確性更高。使用PSA和C18作為凈

10、化劑時，樣品（蘋果、柑橘、大米和卷心菜）基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比1.21，1.12，1.17，0.85。在該方法中，蘋果、柑橘和大米樣品的斜率之比大于1.1，表現(xiàn)出基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)。而卷心菜的斜率之比小于0.9，表現(xiàn)出基質(zhì)效應(yīng)抑制。然而，在分子印跡材料處理過的樣品中，樣品（蘋果、柑橘、大米和卷心菜）的曲線斜率之比分別為1.05，92，1.09和1.05。相比于PSA和C18，分子印跡材料可有效降低或去除基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。