肺腺癌中缺氧誘導因子-1α調(diào)控程序性死亡因子配體1的表達.pdf

1、研究背景及目的：
　　非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，約占肺癌總數(shù)的85％[1]。肺腺癌是非小細胞肺癌的一種重要的病理類型，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。腫瘤細胞免疫逃逸是目前的研究熱點，程序性死亡因子1（programmed death-1，PD-1）及其配體程序性死亡因子配體1(programmed deathligand1，PD-L1)是參與腫瘤免疫逃

2、逸的重要分子，在多種腫瘤中高表達[3]。目前針對PD-1/PD-L1免疫檢查位點的單抗如nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab等已應用于非小細胞肺癌臨床試驗和治療，并取得了令人欣喜的臨床效果[4-6]，但仍存在一些急需解決的問題，如較多患者對藥物沒有反應性、影響藥物療效的機制不明確等[7-8]。因此，研究腫瘤中PD-L1表達特征和相關調(diào)控機制及其在PD-1/PD-L1阻斷治療中的預測和預后價值具有重要臨

3、床意義[9]。缺氧是實體瘤微環(huán)境的重要生物學特征[10]，廣泛存在于大多數(shù)實體瘤中的缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一種轉錄調(diào)節(jié)因子，由HIF-1α亞單位和HIF-1β亞單位組成，其中HIF-1α是氧調(diào)節(jié)單位，是調(diào)控腫瘤細胞多種基因轉錄和蛋白表達適應缺氧環(huán)境的重要因子。近兩年來，有研究報道缺氧條件下HIF-1α可調(diào)控PD-L1的表達[11-14]。然而，肺腺癌中PD-L1的表達是否受缺

4、氧微環(huán)境及HIF-1α調(diào)控影響尚無報道。
　　本實驗擬通過免疫組化法分析臨床肺腺癌組織標本中HIF-1α、PD-L1表達相關性，并利用癌癥基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫驗證組化結果，及分別用CoCl2模擬化學性缺氧和siRNA沉默HIF-1α處理人肺腺癌細胞系，探究肺腺癌中HIF-1α對PD-L1表達的調(diào)控作用和機制。
　　研究方法：
　　應用免疫組織化學方法檢測99例

5、肺腺癌組織中HIF-1α、PD-L1的表達;利用TCGA數(shù)據(jù)庫分別分析230名肺腺癌患利者[15]和178名肺鱗癌患者[16]數(shù)據(jù)組中HIF-1α、PD-L1 mRNA表達相關性;CoCl2模擬化學性缺氧分別處理人肺腺癌細胞NCI-H1975和HCC827，實驗分為Normal組、CoCl2組，qRT-PCR檢測HIF-1α、PD-L1 mRNA表達，Western blotting檢測HIF-1α、PD-L1蛋白表達;siRNA-HI

6、F-1α分別瞬時轉染人肺腺癌細胞NCI-H1975和HCC827，分為NC組、siR-HIF-1α組，qRT-PCR、Westernblotting檢測轉染效率及PD-L1 mRNA和蛋白的表達。
　　結果：
　　1.免疫組化檢測結果顯示，肺腺癌組織中HIF-1α陽性表達呈棕褐色細顆粒，染色定位于細胞核。PD-L1陽性表達呈棕黃色顆粒，染色定位于細胞膜和（或）細胞質。99例肺腺癌組織中，HIF-1α、PD-L1陽性率分別為4

7、7.48％(47/99)、34.34％(34/99)。2.99例肺腺癌組織中，HIF-1α表達水平與患者年齡和臨床分期有關(P＜0.05)，與性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結轉移均無關（P＞0.05）。
　　3.99例肺腺癌組織中，PD-L1表達水平與患者臨床分期有關（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結轉移均無關（P＞0.05）。
　　4.Spearman相關分析法分析免疫組化結果顯示，肺腺癌中HIF-

8、1α蛋白表達和PD-L1蛋白表達正相關（r=0.292，P＜0.01）。進一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫中230名肺腺癌患者組HIF-1α和PD-L1 mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)與組化結果一致，肺腺癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表達正相關（r=0.467，P＜0.001）。此外，我們還分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中178名肺鱗癌患者組HIF-1α和PD-L1 mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)肺鱗癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表達無相關性（r=0.10

9、8，P＞0.05）。
　　5.CoCl2模擬化學性缺氧處理肺腺癌細胞NCI-H197524h后，與Normal組相比，CoCl2組HIF-1α蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)，PD-L1 mRNA及蛋白表達水平隨之明顯升高(P＜0.01); CoCl2模擬化學性缺氧處理肺腺癌細胞HCC82724h后，與Normal組相比，CoCl2組HIF-1α蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)，PD-L1 mRNA及蛋白表達水平隨之明顯升

10、高（P＜0.05）。
　　6.siRNA轉染沉默肺腺癌細胞NCI-H1975 HIF-1α基因，48h后檢測轉染效率確保HIF-1α基因表達下調(diào)，進一步檢測PD-L1表達變化發(fā)現(xiàn)，siR-HIF-1α組與NC組相比，PD-L1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05); siRNA轉染沉默肺腺癌細胞HCC827 HIF-1α基因，48h后檢測轉染效率確保HIF-1α基因表達下調(diào)，迸一步檢測PD-L1表達變化發(fā)現(xiàn)，siR-HI