E64d對(duì)oxLDL致人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)代謝不平衡的慢性炎癥性疾病。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋在血管壁表層，形成了一道防御動(dòng)脈粥樣硬化的天然屏障。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞暴露于高血壓、高血糖、高血脂等危險(xiǎn)因素時(shí)會(huì)發(fā)生內(nèi)皮功能障礙，降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表達(dá)、增加炎性粘附分子產(chǎn)生、破壞細(xì)胞遷移能力。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxL

2、DL)作為血脂升高的關(guān)鍵成分，通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙。E64d是木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（如組織蛋白酶B，CTSB）的小分子抑制劑。因此，E64d涉及自噬溶酶體活動(dòng)的調(diào)節(jié)。已有研究表明E64d對(duì)多種臨床前期病理模型有效，如動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、腦缺血、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性骨髓瘤等。在大鼠腦缺血模型中，E64d能減弱神經(jīng)血管內(nèi)皮凋亡。E64d能夠阻斷細(xì)胞外彈性蛋白降解。彈性蛋白降解對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的管壁重構(gòu)十分重要。這

3、些研究表明E64d可能具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用。然而目前E64d對(duì)內(nèi)皮功能障礙的作用仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)要探究E64d對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用及潛在機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組
　　在oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型建立中，將人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為五組，分別用0、50、100、150、200mg/L oxLDL處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，觀(guān)察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、活力、氧化應(yīng)激、炎性粘附

4、因子、eNOS蛋白表達(dá)和自噬水平的變化;在E64d干預(yù)氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，先將人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為五組，分別以對(duì)照組、150mg/L oxLDL組、150mg/L oxLDL+1μM E64d組、150mg/L oxLDL+5μM E64d組、150mg/L oxLDL+10μM E64d組處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果選出E64d最佳干預(yù)濃度后，再將人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為三組，分別以對(duì)照組、150mg/L oxLDL組、

5、150mg/L oxLDL+1μM E64d組處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、炎性粘附分子、eNOS蛋白表達(dá)和遷移能力的變化;在探討E64d對(duì)自噬影響的實(shí)驗(yàn)中，將人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為三組，分別以對(duì)照組、150mg/L oxLDL組、150mg/L oxLDL+1μM E64d組處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中溶酶體組織蛋白酶B的表達(dá)、細(xì)胞自噬水平(LC3、p62、Beclin1的蛋白表達(dá))、LC3熒光點(diǎn)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和氧化應(yīng)

6、激水平的變化。
　　2.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力
　　CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)oxLDL和（或）E64d對(duì)細(xì)胞活力的影響。以適當(dāng)密度將細(xì)胞均勻接種于96孔板中，37℃孵育12小時(shí)。用不同濃度的oxLDL(0mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L)或150mg/L oxLDL以不同時(shí)間點(diǎn)(0h，6h，12h，24h，48h)或150mg/L oxLDL加不同濃度的E64d(1μM、5μM、1

7、0μM)處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。加入10μL/孔CCK-8試劑，37℃孵育4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。根據(jù)各組吸光度值與對(duì)照組的比值得出細(xì)胞活力。
　　3.酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的氧化應(yīng)激標(biāo)志(MDA、SOD)和炎性粘附分子標(biāo)志(sICAM-1)
　　不同濃度的oxLDL和（或）E64d處理細(xì)胞24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞后離

8、心再重懸。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)。按照ELISA試劑盒中的說(shuō)明檢測(cè)各組培養(yǎng)上清中的MDA、SOD和sICAM-1濃度。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移
　　將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)到單層融合時(shí)用10～20μL塑料槍頭尖端劃痕細(xì)胞，并在6孔板蓋上作標(biāo)記，光鏡拍照。用培養(yǎng)基輕輕沖去細(xì)胞碎片，以對(duì)照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育細(xì)胞24小時(shí)。用光鏡以6孔板蓋上標(biāo)記

9、再次拍照，與不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比。劃痕大小用Image-Pro Plus軟件分析。
　　5.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　收集對(duì)照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育24小時(shí)后各組的所有細(xì)胞，離心（2000轉(zhuǎn)份，5分鐘），洗滌細(xì)胞2次。加入5μL FITC混勻，再加入5μL PI混勻，于室溫避光孵育5～15分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

10、。
　　6.免疫熒光檢測(cè)自噬標(biāo)記LC3點(diǎn)
　　細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)到70％融合時(shí)以對(duì)照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育細(xì)胞24小時(shí)。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，4％多聚甲醛固定30分鐘。再次用PBS沖洗后，用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉15分鐘。PBS沖洗細(xì)胞后，用PBS-3％BSA以1∶200稀釋LC3一抗，4℃孵育過(guò)夜。熒光二抗染色后，細(xì)胞在室溫下避光孵育30

11、分鐘。PBS沖洗后在共聚焦熒光顯微鏡下拍照觀(guān)察。
　　7.透射電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
　　將細(xì)胞接種于T75塑料培養(yǎng)皿，以對(duì)照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育細(xì)胞24小時(shí)。收集各組細(xì)胞，離心（1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，4℃），在4％戊二醛中4℃固定過(guò)夜，通過(guò)處理后用透射電鏡觀(guān)察。
　　8.Western Blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中LC3、p62、Beclin1、

12、eNOS和組織蛋白酶B(CTSB)的蛋白表達(dá)
　　運(yùn)用不同濃度oxLDL和（或）E64d處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，收集各組細(xì)胞。用BCA蛋白分析法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取蛋白20μg上樣于8％或15％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SD S-PAGE)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜于PVD膜上。用5％脫脂奶粉封閉1小時(shí)后按照1∶1000稀釋LC3，1∶1000稀釋p62、1∶1500稀釋Beclin1，1∶200稀釋eNOS，1∶2000稀釋CTSB，

13、1∶800稀釋?duì)?actin一抗抗體，于4℃孵育過(guò)夜。取對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1小時(shí)后洗膜，用電化學(xué)發(fā)光法，將膜于成像系統(tǒng)中拍照。應(yīng)用ImageJ軟件分析電泳條帶的灰度值。
　　結(jié)果:
　　1.oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙、降低自噬流
　　2.E64d減輕oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙
　　3.E64d降低oxLDL誘導(dǎo)的自噬及氧化應(yīng)激
　　結(jié)論:
　　E64d改善oxLDL誘導(dǎo)的與sICAM-1、eNOS、M