二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡病因第二位，嚴(yán)重危害人們的健康。其惡性程度高，治療效果差，病死率較高。肝癌患者5年預(yù)后生存率小于15％，缺乏有效的治療藥物，因此，探索其發(fā)生發(fā)展過程中的特異性機(jī)制，有針對(duì)性的預(yù)防和診斷治療，對(duì)肝癌防治有著重要的意義。
　　腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中需要大量葡萄糖，即使在無氧條件下，惡性腫瘤細(xì)胞更傾向于無氧糖酵解的途徑來獲取能量，這便是著名的瓦博格效應(yīng)。因此，葡萄糖是大多數(shù)惡性腫瘤的能量來

2、源。目前低糖治療已經(jīng)作為一種新的腫瘤治療方式被運(yùn)用到臨床。靶向能量代謝是抗癌治療的一個(gè)新的方向。
　　二甲雙胍是常用的一種降糖藥。近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有一定的抗腫瘤作用，減少糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，增強(qiáng)藥物的療效。有研究報(bào)道，二甲雙胍一方面能夠減少肝臟糖異生和血液中葡萄糖的釋放，限制了肝臟的緩沖功能，并在營養(yǎng)素?cái)z入減少期間加大了血清葡萄糖的降低水平;另一方面，二甲雙胍已被證明是通過直接抑制可能由短期葡萄糖缺乏引起的能量補(bǔ)

3、充消耗的線粒體呼吸復(fù)合物Ⅰ，阻礙癌癥細(xì)胞的生長。2-脫氧-D-葡萄糖，是一種葡萄糖類似物，能夠阻斷葡萄糖代謝，損耗腫瘤細(xì)胞的能力供給。有研究報(bào)道，2-脫氧-D-葡萄糖能增加氧化應(yīng)激，抑制糖基化，并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。也可以有效地延緩細(xì)胞生長，有效促進(jìn)特定的腫瘤細(xì)胞的凋亡。雖然2-脫氧-D-葡萄糖本身在許多類型的癌癥的治療作用有限，它可以結(jié)合其他治療藥物或放射治療具有協(xié)同抗腫瘤作用。
　　細(xì)胞自噬是依賴溶酶體途徑對(duì)胞質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一

4、種過程，在進(jìn)化上具有高度保守性，其在細(xì)胞死亡，細(xì)胞存活，衰老和代謝的生理和病理過程起著重要的作用。更重要的是，自噬是一個(gè)關(guān)鍵的促進(jìn)細(xì)胞存活的應(yīng)激機(jī)制。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)自噬的作用。AKT磷酸化是該通路上的一個(gè)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)腫瘤細(xì)胞存活和凋亡有著重要的作用。本論文通過研究二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖情況，繼而用2-脫氧-D-葡萄糖代替葡萄糖缺乏，聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用，并進(jìn)一步探討促凋亡的

5、機(jī)制，以期為預(yù)防和治療肝癌患者提供新的靶點(diǎn)方向。
　　第一章二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　目的:探索二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　方法:
　　1.用全培養(yǎng)液、無血清培養(yǎng)液以及無葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌HepG2、Hep3B、HCCM、Huh7和PLC/5細(xì)胞，利用Wst-1試劑觀察肝癌細(xì)胞不同時(shí)間段的增殖情況。
　　2.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測全培養(yǎng)液、谷氨酰胺和葡萄糖

6、雙缺乏培養(yǎng)液、葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)液、谷氨酰胺補(bǔ)充培養(yǎng)液以及兩者均補(bǔ)充培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細(xì)胞48h后的subG1凋亡率。
　　3.把二甲雙胍加入到培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)分成四組，全培養(yǎng)液組，二甲雙胍全培養(yǎng)液組、無葡萄糖培養(yǎng)液組和二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組，培養(yǎng)肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞，分別在24h和48h后觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，然后利用流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測肝癌細(xì)胞的存活情況。
　　4.運(yùn)用蛋白免疫印跡技術(shù)分析全培養(yǎng)液組、二甲雙胍全培養(yǎng)液組

7、、無葡萄糖培養(yǎng)液組和二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組培養(yǎng)的肝癌Huh7細(xì)胞的PARP、Caspase-3、Mcl-1、LC3及p-AKT等相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.無葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比較全培養(yǎng)液和無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞，增殖率隨著時(shí)間逐漸下降，其中肝癌HepG2、HCCM細(xì)胞變化最明顯。
　　2.葡萄糖和谷氨酰胺雙缺乏培養(yǎng)液和谷氨酰胺補(bǔ)充培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞subG1凋亡率分別為（94.

8、00±0.50）％和(74.80±1.92)％，與全培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞subG1凋亡率(4.40±0.21)％、葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)液（11.00±0.21）％和兩者均補(bǔ)充培養(yǎng)液（7.20±0.29）％相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而五組培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5細(xì)胞的subG1凋亡率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.顯微鏡下二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組培養(yǎng)的肝癌Huh7細(xì)胞48h后數(shù)量明顯減少，密度降低。

9、>　　4.二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組的死亡率為（74.97±0.21）％，與無葡萄糖培養(yǎng)液組（32.69±0.89）％、二甲雙胍全培養(yǎng)液組（11.98±0.29）％及全培養(yǎng)液組（7.74±0.23）％比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;無葡萄糖培養(yǎng)液組的死亡率為（32.69±0.89）％，與二甲雙胍全培養(yǎng)液組（11.98±0.29）％及全培養(yǎng)液組（7.74±0.23）％比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.蛋白免疫印跡技術(shù)顯示，二甲雙胍無葡萄糖

10、培養(yǎng)液組可以觀察到明顯的Caspase-3激活、PARP切割，Mcl-1表達(dá)的降低，以及AKT的磷酸化，自噬相關(guān)蛋白LC3B的減少。
　　結(jié)論:
　　1.葡萄糖缺乏能夠抑制肝癌HepG2、HCCM細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
　　2.肝癌HepG2、HCCM細(xì)胞的存活對(duì)葡萄糖缺乏比較敏感，而肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5細(xì)胞比較耐受。
　　3.二甲雙胍能促進(jìn)在葡萄糖缺乏條件下肝癌Huh7細(xì)胞的凋亡。

11、　　4.二甲雙胍能促進(jìn)在葡萄糖缺乏條件下肝癌Huh7細(xì)胞的凋亡可能與AKT磷酸化和自噬有關(guān)。
　　第二章二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響
　　目的:探討二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖拮抗劑2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及其凋亡相關(guān)蛋白的改變。
　　方法:
　　1.不同濃度二甲雙胍全培養(yǎng)液和2-脫氧-D-葡萄糖全培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，48h后利用Wst-1試劑觀察肝癌細(xì)胞的增殖情況。

12、
　　2.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖單獨(dú)及聯(lián)合培養(yǎng)肝癌Hep3B、HepG2細(xì)胞，48h后利用Wst-1試劑觀察肝癌細(xì)胞的增殖情況。
　　3.顯微鏡下觀察二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖單獨(dú)及聯(lián)合作用肝癌HepG2、Hep3B細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測全培養(yǎng)液組、二甲雙胍全培養(yǎng)液組、2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)液組、二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)肝癌HepG2和Hep3B細(xì)胞48h后的subG

13、1死亡率。
　　5.運(yùn)用蛋白免疫印跡技術(shù)分析二甲雙胍單獨(dú)及聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞PARP、Caspase-3及Mcl-1相關(guān)凋亡蛋白的改變。
　　結(jié)果:
　　1.隨著二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖的濃度上升，肝癌細(xì)胞HepG2、HCCM、Hep3B及PLC/5的增殖率下降，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　2.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞的存活率為（22.48±0.51

14、）％，與二甲雙胍培養(yǎng)液組（80.68±5.10）％、2-脫氧-D-葡萄糖組（72.56±4.34）％以及對(duì)照組（100.00±5.05）％比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌Hep3B細(xì)胞的增殖率(29.16±1.34)％，與二甲雙胍培養(yǎng)液組（59.58±1.92）％和對(duì)照組（100.00±1.23）％比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)液組（33.87±1.95）％比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)

15、學(xué)意義。
　　3.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖聯(lián)合處理使得HepG2細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮、脫落;而聯(lián)合組雖然也造成Hep3B、Huh7細(xì)胞密度降低，但并未顯著增加脫落的死細(xì)胞。
　　4.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞的subG1凋亡率（39.63±0.21）％，明顯高于對(duì)照組（7.12±0.14）％、二甲雙胍組（12.56±0.35）％和2-脫氧-D-葡萄糖組（15.16±1.93）％，差

16、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; Hep3B細(xì)胞聯(lián)合組的凋亡率為(12.58±1.03)％，與對(duì)照組（2.82±0.51）％和二甲雙胍組（8.98±0.86）％比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與2-脫氧-D-葡萄糖組（12.40±1.78）％比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.蛋白免疫印跡技術(shù)顯示，聯(lián)合組可以觀察到明顯的Caspase-3激活、PARP切割，以及Mcl-1表達(dá)的降低。
　　結(jié)論:
　　1.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖能