早期冠心病miRNA標志物熒光診斷技術與系統(tǒng)研究.pdf

1、熒光檢測在醫(yī)學檢驗、食品衛(wèi)生、動植物檢驗檢疫上應用廣泛。利用熒光檢測方法對核酸進行定量分析和特異性識別在生物醫(yī)學上具有重要的意義。核酸中的MicroRNA(miRNA)與生命體發(fā)展過程中多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。在調控時間順序上，miRNA對基因表達的調控先于蛋白變化，因此，可作為潛在的疾病早期診斷標志物。但是，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法大多操作步驟繁瑣，檢測時間長，需要使用價格昂貴的檢測儀器，操作人員需要專門培訓，檢測成本高。難以滿

2、足快速、即時檢測低豐度miRNA的要求。本研究利用miRNA可對某些疾病提前表達的特性，基于滾環(huán)擴增(RCA)檢測miRNA技術，通過對特異性miRNA進行標記，利用光電檢測方法，根據(jù)標志物受激發(fā)出的熒光強度分析得出miRNA的初始濃度。為特異性miRNA快速、即時檢測提供一種新技術，利用此技術開發(fā)的miRNA熒光檢測系統(tǒng)可為冠心病等慢性疾病提供進行風險分層和早期預警的儀器。研究圍繞熒光快速檢測，具體做了以下幾方面的工作:
　　從

3、熒光產生的機理出發(fā)，通過理論分析，計算出采用共焦式熒光檢測系統(tǒng)和非共焦式熒光檢測系統(tǒng)結構可以產生的熒光光子數(shù)。分析出若采用共焦結構，激發(fā)光光功率1.2mW，則要求光電探測器最低探測靈敏度不低于2.77×10-7W;若采用非共焦結構，在相同光照強度下，要求光電探測器最低探測靈敏度不低于1.98×10-7W。依據(jù)理論計算結果選擇非共焦結構中的正入射結構為本研究miRNA熒光檢測系統(tǒng)的光學結構。
　　根據(jù)miRNA熒光檢測特點，系統(tǒng)設計

4、上選擇采用滾環(huán)擴增(RCA)技術對冠心病特異性miRNA進行擴增，采用SYBR GreenⅡ熒光染料作為熒光標記物，依據(jù)熒光染料參數(shù)選擇相應的光源為發(fā)光二極管(LED)，探測器為光電倍增管(PMT)。根據(jù)滾環(huán)擴增(RCA)方式和熒光檢測結構特點，通過理論計算，選擇使用半導體加熱作為miRNA熒光檢測系統(tǒng)的加熱方式。通過對激發(fā)光光束進行光學整形設計，使其滿足系統(tǒng)的應用要求。對樣品池進行設計，使其既利于滾環(huán)擴增(RCA)反應，又方便熒光信號

5、探測，且隔絕了不同樣品之間熒光信號的串擾。最后，通過軟件設計，完成數(shù)據(jù)處理及人機交互。
　　通過設計相應的驗證實驗，獲得miRNA熒光檢測系統(tǒng)的多項技術指標。得出miRNA熒光檢測系統(tǒng)熒光強度線性偏倚不超過±5％、重復性不低于95％、系統(tǒng)最低檢出限為12個拷貝等指標。使用miRNA熒光檢測系統(tǒng)，對從心肌細胞中提取的冠心病標志物miR-499進行滾環(huán)擴增(RCA)。從檢測結果可以看出，miRNA熒光檢測系統(tǒng)可以滿足冠心病特異性miR

6、NA實時檢測的目的。實驗得出通過合理設置滾環(huán)擴增反應條件，冠心病特異性miRNA檢測所需時間低于30分鐘。
　　通過驗證實驗得出miRNA熒光檢測系統(tǒng)檢測靈敏度與實時熒光定量PCR儀靈敏度相近，但miRNA熒光檢測系統(tǒng)檢測miRNA所需時間遠低于實時熒光定量PCR儀檢測miRNA所需時間。這為特異性miRNA快速、即時檢測提供了一種有價值的檢測技術。miRNA熒光檢測系統(tǒng)采用正交式檢測結構，通過整體設計，降低系統(tǒng)背景光噪聲，提高熒