自由能計算方法在耐藥性機制分析和遺傳病治療中的應用.pdf

1、化學藥物在疾病的治療中起到了關鍵的作用，但部分化學藥物的重復使用會最終導致其藥效的下降甚至失活，主要原因是靶蛋白對藥物產(chǎn)生了抗性或耐受性。耐藥性經(jīng)常由靶蛋白的次級突變所引起，其宏觀現(xiàn)象通常表現(xiàn)為抑制劑與突變靶標結合能力下降。如何正確理解耐藥性產(chǎn)生的分子機制，進而為抗耐藥性藥物的發(fā)現(xiàn)和設計提供可靠依據(jù)已成為當今藥物研發(fā)領域亟待解決的難題。通過 X射線衍射和核磁共振技術可以得到蛋白質?配體復合物的三維結構，從而獲悉配體與靶點的相互作用模式。

2、但是當有眾多藥物和眾多耐藥突變蛋白時，我們很難通過實驗方法獲得突變體復合物的所有晶體結構。隨著理論方法的發(fā)展和計算設備性能的不斷提升，分子模擬技術已成為耐藥性機制研究不可或缺的工具。本論文擬從自由能計算的角度揭示藥物耐藥性產(chǎn)生的分子機制，并對由“獲得功能性”（gain of function）和“喪失功能性”（loss of function）突變引起的遺傳病的治療提出化學藥物的治療策略。
　　由于目前自由能計算的方法眾多，精度不

3、同，而且在很大程度上存在體系特異性，因此在耐藥性機制研究之前，我們首先對應用最為廣泛的兩點式自由能計算方法（MM/PB(GB)SA）做了整體的精度評估，并提出提高預測精度的計算策略。隨后，我們提出基于分子對接和 MM/PB(GB)SA重打分的計算策略，計算結果表明，MM/GBSA重打分可有效提高傳統(tǒng)分子對接的預測精度，此策略適用于沒有晶體結構體系的耐藥性分析。
　　我們將MM/GBSA方法用于兩個體系（crizotinib-ALK

4、和crizotinib-ROS1）的耐藥性機制研究。對于ALK體系，MM/GBSA自由能計算表明，耐藥性突變L1152R和G1202R會嚴重影響體系構象熵的變化，而且所研究的3個耐藥性突變（L1152R、G1202R、S1206Y）都會影響藥物?靶標間氫鍵的變化。此外，我們還通過加強采樣的自由能計算（ABF）表征了crizotinib從野生型及突變型ALK中的解離路徑。研究表明，G1202R和S1206Y會阻礙crizotinib與AL

5、K中結合通道的結合，因而導致crizotinib的結合通路耐藥性。對于ROS1體系，我們使用了更為先進的加強采樣自由能算法（funnel-based metadynamics和 absolute binding free energycalculation based on umbrella sampling）表征了crizotinib對ROS1激酶結合/解離過程的二維勢能面。發(fā)現(xiàn)與野生型ROS1激酶相比，G2032R突變體中P-loo

6、p區(qū)域的開口幅度更大，其直接導致 crizotinib在突變型 ROS1結合口袋中的保留時間（residence time）顯著下降，因而導致強烈的耐藥性。
　　最后，我們分析了遺傳病相關的靶標突變對小分子結合的影響，并提出了化學藥物治療遺傳病的治療策略。其原理在于“獲得功能性”或“喪失功能性”遺傳病的治療可以通過使用其對應靶點的拮抗劑（antagonist）或激動劑（agonist）來抑制或激活其功能。然而，這種化學療法必須滿足

7、一個前提，即這些“獲得功能性”或“喪失功能性”的靶標突變并不會對化學藥物的結合產(chǎn)生不良影響。因此我們利用分子對接和 MM/GBSA自由能重打分的方法評測了已知成功藥物靶標的遺傳病相關突變位點對上市藥物結合能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)情況下這些疾病相關突變位點并不會對藥物的結合產(chǎn)生不良影響。與此同時，我們也注意到在我們所統(tǒng)計數(shù)據(jù)中已有20~50％的化學藥物已在不同種類的遺傳病中得到試驗和應用，因此以上分析支持使用化學藥物對遺傳疾病進行治療