聯(lián)合應用ROCK2及GSK-3β抑制劑促進新生大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪后突起再生的實驗研究.pdf

1、目的：
　　新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxia ischemic encephalopathy，HIE）是由于圍生期窒息導致的缺氧缺血性腦損害，是導致新生兒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥如腦癱、智力障礙和癲癇的重要原因，但目前仍然缺乏有效的措施能夠改善因圍產期窒息所致的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞骨架降解在缺氧缺血后神經(jīng)細胞損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而細胞骨架又是介導神經(jīng)元軸突的發(fā)生、延長與再生的關鍵。神經(jīng)元細胞骨架的兩個重

2、要成分肌動蛋白絲（f-actin）與微管（β-tubulin）分別受Rho/ROCK及AKT/GSK-3β信號通路的調控，因此，本研究將從神經(jīng)元細胞骨架的整體調控出發(fā)，以體外培養(yǎng)的SD大鼠皮層神經(jīng)元為研究對象，觀察氧糖剝奪（OGD）后，分別聯(lián)合應用ROCK2抑制劑法舒地爾（Fasudil）、GSK-3β抑制劑（TDZD-8）以及兩者聯(lián)合應用對細胞骨架蛋白的保護、神經(jīng)元突起再生及細胞凋亡的影響，為臨床上開發(fā)聯(lián)合用藥治療新生兒缺氧缺血性腦病

3、提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　取新生24h SD大鼠，按照Beaudoin的方法將皮層神經(jīng)元在體外培養(yǎng)至7d后，隨機分為5組：正常對照組（不做任何處理），缺氧復氧組（OGD后單純復氧），F(xiàn)asudil組（OGD后復氧同時加入Fasudil），TDZD-8組（OGD后復氧同時加入TDZD-8），聯(lián)合用藥組（OGD后復氧同時加入Fasudil與TDZD-8）；參考Alluri的方法建立氧糖剝奪模型（oxygen and glu

4、cose deprivation，OGD），各組使用相應藥物處理后，用細胞增殖與活性檢測試劑盒（CCK8）檢測細胞活性，原位末端標記染色法（TUNEL）檢測細胞凋亡率，神經(jīng)元標志性蛋白β-3 tubulin免疫熒光標記下測量神經(jīng)元突起長度，免疫熒光染色比較f-actin及β-tubulin表達情況，Western Blot檢測信號通路蛋白及細胞骨架蛋白ROCKII、p-GSK-3β、f-actin、β-tubulin的表達量。實驗結果以

5、均數(shù)±標準差(x?s)表示。數(shù)據(jù)應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　?、磐ㄟ^CCK-8法檢測各濃度梯度的細胞活性，確定了Fasudil和TDZD-8的最佳濃度分別是10μmol/L(1.37±0.08,P<0.05)和1μmol/L(1.36±0.08,P<0.05)，并將上訴藥物濃度用于進一步研究。與正常對照組相比，缺氧復氧組的細胞活性

6、顯著降低(0.58±0.04,P<0.05)，進行藥物干預后，F(xiàn)asudil組（1.37±0.09）和TDZD-8組（1.36±0.08）細胞活性明顯提高(P<0.05)；相比單獨用藥，聯(lián)合用藥組對細胞活性有更顯著地提高(1.67±0.06,P<0.05)。⑵正常對照組、缺氧復氧組、Fasudil組、TDZD-8組、聯(lián)合用藥組神經(jīng)元凋亡率分別是：7.20±1.76，68.34±4.15，40.11±2.74，39.43±2.98，30.

7、46±2.27；結果表明氧糖剝奪后細胞凋亡率顯著增加（P<0.05），F(xiàn)asudil和TDZD-8具有一定神經(jīng)保護作用，可以減少細胞凋亡（P<0.05），而聯(lián)合用藥能夠產生協(xié)同作用，進一步降低細胞凋亡率（P<0.05）。⑶利用神經(jīng)元標志性蛋白β-3 tubulin進行熒光染色，通過Image-Pro-Plus6.0（IPP）測量神經(jīng)元最長突起長度，進行組間比較。結果顯示，與正常對照組(242.37±7.78)相比，缺氧復氧組神經(jīng)突起長度

8、明顯縮短(100.21±10.03,P<0.05)，而Fasudil組和TDZD-8組神經(jīng)突起長度均大于缺氧復氧組(174.14±5.91,170.79±9.17,P<0.05)，但小于聯(lián)合用藥組(207.00±9.71, P<0.05)，表明聯(lián)合用藥可以更好的保護神經(jīng)元形態(tài)，促進突起再生。⑷為了觀察氧糖剝奪及Fasudil與TDZD-8對細胞骨架蛋白的作用，我們通過對f-actin及β-tubulin進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪之后

9、，神經(jīng)元失去了正常的細胞形態(tài)，f-actin及β-tubulin的表達強度顯著降低，而Fasudil組和TDZD-8組均可以維持正常的神經(jīng)元的形態(tài)，f-actin及β-tubulin的表達強度均強于缺氧復氧組，但有所差別，F(xiàn)asudil組在f-actin上有更高的表達強度，而TDZD-8組在β-tubulin的表達上更顯著。聯(lián)合用藥組在f-actin及β-tubulin的表達上更加均衡，更接近于正常對照組。⑸氧糖剝奪后，ROCK2表達明

10、顯增加，p-GSK3β大幅下調，f-actin及β-tubulin的表達均明顯減少（P<0.05）；應用Fasudil后，ROCK2表達顯著減少（P<0.05），p-GSK3β表達無明顯改變（P>0.05），f-actin及β-tubulin表達均明顯增加（P<0.05），但f-actin增加更為顯著（P<0.05）；而應用TDZD-8后，p-GSK3β表達顯著增加（P<0.05），對ROCK2的表達無明顯影響（P>0.05），f-ac

11、tin及β-tubulin表達增多（P<0.05），以β-tubulin增加更為顯著（P<0.05）；與單獨用藥相比，聯(lián)合用藥在減少ROCK2表達及上調p-GSK3β活性上具有協(xié)同作用（P<0.05），f-actin及β-tubulin的表達均比單獨用藥明顯增加（P<0.05）。根據(jù)上面的結果，我們推ROCK2及p-GSK3β均參與了OGD誘導的細胞骨架崩解，F(xiàn)asudil可以通過調節(jié)ROCK2保護f–actin，而TDZD-8主要通過

12、抑制GSK3β保護β-tubulin，因此，聯(lián)合Fasudil和TDZD-8可以更好地保護細胞骨架的完整性。
　　結論：
　　氧糖剝奪之后，神經(jīng)細胞骨架被破壞，細胞骨架重要組成蛋白表達量減少，導致神經(jīng)元突起短縮，細胞凋亡增加。單獨應用 Fasudil或 TDZD8后，可以在一定程度上維持細胞骨架形態(tài)，減少細胞骨架蛋白降解，促進神經(jīng)元突起生長，減少細胞凋亡，但與正常神經(jīng)元相比，仍有一定差距；聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，可以更好的保護