小鼠胚胎成纖維細胞重編程過程中p53、MDM2、Aurka基因相關性的實驗研究.pdf

1、目的:研究攜帶有轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的腺病毒感染小鼠胚胎成纖維細胞(MEFc)，通過誘導出誘導多能干細胞
　　（iPSC），并分析在重編程過程中p53基因、MDM2基因、Aurka基因的變化規(guī)律，為提高誘導多能干細胞誘導效率提供思路。
　　方法：1.對前期凍存的MEFc進行復蘇，待MEFc生長良好后，加入帶有4個轉錄因子（OSCK）的腺病毒，反復感染兩次后，觀察細胞形態(tài)結構變化；2.對誘導出的

2、細胞進行多能性鑒定：通過對細胞形態(tài)學觀察、成瘤性、堿性磷酸酶(偶氮偶聯法)染色，及干細胞標志基因檢測；3.將轉染的細胞分別按照誘導前、誘導后24h、誘導后1w、誘導后2w四個時間段，利用Real-Time PCR技術，多次測量p53基因、MDM2基因、Aurka基因的轉錄情況。實驗數據應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，各個基因內各個時間的數據采用單因素方差分析，統計學檢驗標準為P<0.05。
　　結果：1.對誘導的細胞進行多

3、能性鑒定：a、形態(tài)學變化：可觀察到細胞邊界輪廓清楚，胞體較小鼠成纖維細胞變大，變圓，長度變短，少數呈多變性，仍有明顯突起，但突起長度變短。b、成瘤性觀察：約7-8周后可見到大鼠根部明顯2-3個畸胎瘤，用手觸及包塊質中等硬度，可滑動，與周圍組織無粘連，表面光滑。取出包塊組織，可見到包塊淡紅色塊橢圓形柱狀物，大小為約1cm×0.5cm×0.3cm。將取下的組織行切片、HE染色處理，可見細胞核成藍色，胞質成粉紅色，在中可見到大量杯狀細胞組成的

4、腺體組織、血管、大量的脂肪組織。c、堿性磷酸酶鑒定：可見大量堿性磷酸酶陽性顆粒。d、干細胞標志基因檢測：Oct4、Sox2及Nanog在誘導的細胞中均有表達。2.在誘導過程中p53轉錄變化規(guī)律：1、轉染前與轉染后24h、轉染后1w、轉染后2w比較，相對表達量差異顯著（P<0.05）。2、轉染后24h與轉染后1w及轉染后兩周比較，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。3.轉染后1w與轉染后兩周比較，差異顯著，具有統計學意義(P<0.0

5、5)。p53的轉錄在四因子腺病毒轉染后24h既出現升高，在轉染1w后較高，而在轉染2w后出現下降。在誘導過程中MDM2轉錄變化規(guī)律:1、轉染前與轉染后24h、轉染后1w、轉染后2w比較，RQ差異顯著，具有統計學意義（P<0.05）。2、轉染后24h與轉染后1w及轉染后兩周比較，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。3、轉染后1w與轉染后兩周比較，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。MDM2的轉錄在四因子腺病毒轉染后24h出現下

6、降，1w時下降明顯，而在轉染2w后卻出現升高。與p53基因的變化規(guī)律成反比。在誘導過程中AURKA轉錄變化規(guī)律:1、轉染前與轉染后24h、轉染后1w，RQ差異顯著，具有統計學意義（P<0.05），與轉染后2w比較， RQ差異不顯著（P>0.05）。2、轉染后24h與轉染后1w及轉染后2w比較，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。3、轉染后1w與轉染后2w比較，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。可認為Aurka的轉錄在四因子

7、腺病毒轉染后出現明顯升高，1w時較轉染后仍高，而在轉染2w呈現與正常水平,且Aurka的轉錄升高水平明顯高于p53基因。通過利用MDM2與Aurka的抑制劑發(fā)現細胞p53蛋白表達均明顯升高。
　　結論1.細胞的重編程過程能夠激活p53信號通路，p53轉錄在轉染2w后出現下降，考慮重編程已經完成，可考慮干預重編程過程的時間在2w內。2.細胞重編程過程中MDM2水平下降，通過利用MDM2拮抗劑在誘導多能干細胞中發(fā)現p53蛋白表達明顯增