酶活測(cè)法

1、酶活測(cè)定的方法酶活測(cè)定的方法[測(cè)定酶活測(cè)定酶活]1.MDA的測(cè)定的測(cè)定【原理】丙二醛在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（355三甲惡唑24二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDATBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性

2、糖的干擾?！驹噭?.5%10%TBATCA（1）、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：稱取硫代巴比妥酸，先加少量氫氧化鈉（1molL）溶解，再用10%的三氯乙酸定容。（2）、10%三氯乙酸（TCA）：10g三氯乙酸，蒸餾水定容至100ml。【實(shí)驗(yàn)步驟】稱取剪碎試材0.15g，加入3mL10%TCA（三氯乙酸），可多次加入↓4000rmin離心15min↓吸取上清液3mL（對(duì)照加2mL蒸餾水），加入0.6%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液1mL

3、，混勻，將混合物于沸水浴中反應(yīng)15min，迅速在冷水中冷卻?！∩锨逡簻y(cè)定450﹑532和600nm波長(zhǎng)下的消光度。按下式直接計(jì)算得植物樣品提取液中MDA的濃度。計(jì)算丙二醛含量C=6.45（A532A600）－0.56A450單位：μmolL【步驟】粗酶液提取：取植物材料0.1g（材料重量記錄），用預(yù)冷的PBS在預(yù)冷的研缽中研磨，加入2mL含有0.05molL磷酸緩沖液(pH=7.8)，分次加入PBS，勻漿液在低溫離心機(jī)(4℃)中經(jīng)10

4、000g離心40min。上清液用于測(cè)定（樣品液總體積記錄）。取透明度高的試管3支，2支為對(duì)照管，1支為測(cè)定管。試劑123反應(yīng)介質(zhì)ml444酶提取液μl100100100磷酸緩沖液ml00備注待測(cè)樣品空白無酶反應(yīng)液（對(duì)照）↓2號(hào)管用黑紙包上，比色時(shí)作空白對(duì)照，與其余2支管一起放在熒光燈下，光強(qiáng)60μmolm2s，照光30min，然后用黑布罩上?！圆徽展獾膶?duì)照管作空白，分別測(cè)定其它各管的吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次。計(jì)算計(jì)算SOD總活力=??