當歸多糖對人牙髓細胞增殖和成骨方向誘導(dǎo)分化的影響.pdf

1、目的:本試驗采用體外培養(yǎng)人牙髓細胞的方法建立實驗?zāi)Ｐ停芯慨敋w多糖(Angelica Polysaccharides，APS)對體外分離培養(yǎng)的人牙髓細胞增殖與成骨方向分化的影響。
　　方法:
　　1牙髓細胞的分離培養(yǎng)和鑒定:取正畸或阻生拔除的健康年輕恒牙，運用改良組織塊培養(yǎng)法獲得體外人牙髓原代細胞并常規(guī)傳代;取對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞進行爬片，按SP試劑盒說明書用SABC法進行波形絲蛋白和角蛋白的免疫組化染色，于倒置

2、顯微鏡下觀察。
　　2牙髓細胞增殖活性檢測:
　　2.1Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測細胞增殖活性:
　　取處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞以2×104cells/ml的細胞濃度分別接種于5個96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將這5組細胞隨機分為4個實驗組和1個對照組，實驗組分別加入含1％胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)液配制的四個不同濃度的當歸多糖(50、100、200、400μ moL/l);

3、對照組加入含1％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，每孔加液量為200微升，每板余出一列培養(yǎng)孔不加液（作為空白對照組）。分別于培養(yǎng)后的第3、6、12、24、48h棄去96孔板內(nèi)原液體，加入110μl經(jīng)純DMEM培養(yǎng)液稀釋后的CCK-8（DMEM和CCK-8的濃度配比為10∶1），隨后重新置入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育2h，以空白對照孔調(diào)零，取出后在酶標儀上測定450nm波長下各孔的吸光度值(A450)。
　　3牙髓細胞成骨方向分化能力檢測

4、:
　　3.1Ⅰ型膠原(CollⅠ)的表達:
　　取處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，按照2×104cells/ml的細胞濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶3ml，共8瓶。將這8組細胞隨機分為4個對照組和4個加藥組，分別于培養(yǎng)后的第3、6、12、24h用PBS清洗3遍，加入Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打待細胞完全溶解后，收集瓶內(nèi)液體于無酶EP管中，置于-80℃冰箱保存。由北京賽百盛基因有限技術(shù)公

5、司合成Ⅰ型膠原(CollⅠ)引物，并檢測該基因的表達。
　　3.2ALP活性表達:
　　取處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞以2×104cells/ml的細胞濃度分別接種于5個96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將這5組細胞隨機分為4個實驗組和1個對照組，實驗組分別加入含1％ FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液配制的四個不同濃度的當歸多糖(50、100、200、400μmoL/l);對照組加入含1％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，每孔加液量為200微升，

6、每板余出一列培養(yǎng)孔不加液（作為空白對照組）。分別于培養(yǎng)后的第6、12、24、48、72h棄去96孔板內(nèi)原液體，經(jīng)PBS緩沖液反復(fù)清洗3次并吸干后，每孔分別加入50μ l0.1％ TritonX-100，于4℃冰箱內(nèi)過夜。次日，按照ALP試劑盒說明書加入底物，每孔加入量為100μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育30min后取出，每孔分別加入0.2mol/L NaOH50μl終止反應(yīng)，以空白對照孔調(diào)零，取出后在酶標儀上測定410nm波長下

7、各孔的吸光度值(A410)。
　　3.3骨鈣素(osteocalcin，OC)合成的表達:
　　取處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，按照2×104cells/ml的細胞濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶3ml，共14瓶。將這14組細胞隨機分為7個對照組和7個加藥組，分別于培養(yǎng)后的第1、3、5、7、9、11、13天后用PBS清洗3遍，加入Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打待細胞完全溶解后，收集瓶內(nèi)液體

8、于無酶EP管中，置于-80℃冰箱保存。由北京賽百盛基因有限技術(shù)公司合成OC引物，并檢測該基因的表達。
　　3.4礦化結(jié)節(jié)形成的觀察:
　　茜素紅染色:取處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，按照2×104cells/ml的細胞濃度接種于6孔板中，分為未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組，每組設(shè)5個復(fù)孔，隔日換液。分別在培養(yǎng)后的第7、14、28天，取出6孔板，PBS清洗3遍，用4％甲醛溶液固定約10～15min后，PBS

9、再次清洗3遍，隨后以1％茜素紅染色10min，反復(fù)蒸餾水清洗，直至吸出液體呈無色透明狀。倒置相差顯微鏡下觀察、拍片記錄其變化過程。
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作單因素方差分析，采用S-N-K法進行多重比較。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差的形式，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)人牙髓細胞來源鑒定:體外分離培養(yǎng)的人牙髓細胞經(jīng)免疫組化染色結(jié)果為波形蛋白陽性表達，角蛋白陰性表達，

10、證實該細胞來源于中胚層間充質(zhì)細胞，與實驗要求相一致。
　　2.當歸多糖對牙髓細胞增殖能力的影響:與對照組相比，在一定的濃度范圍內(nèi)，當歸多糖可以促進牙髓細胞的增殖，并在作用時間為12h，藥物濃度為200μmoL/l時可達到其作用峰值。
　　3.當歸多糖對牙髓細胞成骨方向分化的各個時期都具有一定的促進作用。
　　結(jié)論:
　　本實驗結(jié)果證實當歸多糖對人牙髓細胞的增殖和成骨方向分化均有一定的促進作用，且與作用時間以及藥物