簡(jiǎn)介：登革熱病毒DENGUEVIRUS是一種能夠引發(fā)登革熱疾病的黃病毒屬病毒，病患區(qū)主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界上五分之二的人口將面臨罹患登革熱的危險(xiǎn)。全球每年有超過(guò)5000萬(wàn)的登革熱感染病例，其中50萬(wàn)例發(fā)展為登革出血熱DHF和登革休克綜合征DSS，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。由于登革熱較高的死亡率，它已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病之一。遺憾的是，這種疾病在預(yù)防免疫方面，目前尚未研制出有效的疫苗。在疾病治療方面，也未能有針對(duì)性的藥物問(wèn)世。因此，找到有效抗登革熱病毒的抑制劑已經(jīng)迫在眉睫。登革熱病毒是單股正鏈RNA病毒，可翻譯成三種結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白C，膜結(jié)合蛋白PRM和包膜蛋白E和七種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。其中NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶的作用，與NS2B蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，該復(fù)合物在病毒的多聚蛋白轉(zhuǎn)錄和水解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。通過(guò)抑制蛋白酶復(fù)合物的活性我們可以阻斷病毒的生長(zhǎng)和繁殖。隨著2006年第一個(gè)活性登革熱絲氨酸蛋白酶的單晶衍射結(jié)構(gòu)的測(cè)定和2011年四肽醛抑制劑BZNLELYSARGARGH與登革熱絲氨酸蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的解析，設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的絲氨酸蛋白酶抑制劑已經(jīng)具備了先決條件。本文以登革熱絲氨酸蛋白酶為靶點(diǎn)，基于蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，參考已報(bào)道的四肽醛BZNLELYSARGARGHKI58ΜM的結(jié)構(gòu)，以三肽醛LYSBOCARGPBFLYSCBZH為母核結(jié)構(gòu)，通過(guò)選擇不同的LINKER構(gòu)建一系列環(huán)肽小分子化合物，合理設(shè)計(jì)優(yōu)化后進(jìn)行了生物活性篩選。其中合成的目標(biāo)化合物Ⅲ和X對(duì)DENV2絲氨酸蛋白酶的抑制率均超過(guò)50％，目標(biāo)化合物Ⅲ的抑制率目標(biāo)化合物Ⅲ的IC50值為35ΜM，EC50值為33ΜM，為設(shè)計(jì)針對(duì)絲氨酸蛋白酶NS2BNS3PRO為靶點(diǎn)的抗登革熱病毒的抑制劑提供了一定的參考依據(jù)。

簡(jiǎn)介：第一部分EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及殺傷效果鑒定目的研究EB病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞EBVCTL體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，并檢測(cè)其殺傷的效果。方法采集EBV血清抗體陽(yáng)性的6例正常供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC），用EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系（BLCL）作為抗原遞呈細(xì)胞及抗原刺激劑經(jīng)輻照滅活后不斷刺激培養(yǎng)自體PBMNC，誘導(dǎo)產(chǎn)生EBVCTL，并將其擴(kuò)增培養(yǎng)；采用流式細(xì)胞儀鑒定其免疫表型；然后檢測(cè)不同效靶細(xì)胞比例條件下EBVCTL對(duì)自體BLCL、自體植物血凝素培養(yǎng)的B淋巴母細(xì)胞（PHABLAST）、HLA不合供體的BLCL（ALLOBLCL）、K562細(xì)胞株的殺傷效果。結(jié)果6例EBV血清抗體陽(yáng)性正常供體來(lái)源的PBMNC在體外成功篩選并擴(kuò)增培養(yǎng)了EBVCTL，擴(kuò)增效率為PBMNC數(shù)的186550倍。刺激10次培養(yǎng)后的EBVCTL對(duì)自體BLCL在201，101，51三種效靶細(xì)胞比例條件下特異性殺傷效率的平均值分別為594、432、290；對(duì)PHABLAST、ALLOBLCL、K562的非特異性殺傷率在上述三種效靶細(xì)胞比例下平均值依次為71、94、103（P﹤005），66、83、81（P﹤005），54、73、63（P﹤005）。結(jié)論EBVCTL能有效在體外篩選培養(yǎng)并擴(kuò)增，并能有效殺傷HLA相合的BLCL；可望成為EBV相關(guān)性移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病的過(guò)繼免疫治療的有效方法。第二部分異基因造血干細(xì)胞移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病的臨床分析目的提高對(duì)異基因造血干細(xì)胞移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾?。≒TLD）的認(rèn)識(shí)，探討其有效的治療策略。方法回顧性分析2006年1月至2011年12月我院行異基因造血干細(xì)胞移植的524例病例，其中同胞全相合移植299例，無(wú)關(guān)供體相合移植149例，親緣半相合移植51例，臍血移植25例。結(jié)果根據(jù)臨床表現(xiàn)及病理結(jié)果共確診7例PTLD；在上述四種移植類型中PTLD發(fā)病率依次為03（1299），27（4149），20（151），40（125）；后三者發(fā)病率均高于同胞全相合移植組（P044）；在預(yù)處理應(yīng)用抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）的患者中發(fā)病率為27（6225），明顯高于無(wú)ATG者（1299P046）。7例PTLD臨床表現(xiàn)特征主要分為兩類6例發(fā)生在移植后2至8個(gè)月，播散性起病，正規(guī)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效的發(fā)熱，淋巴結(jié)進(jìn)行性腫大，血象三系進(jìn)行性下降，EB病毒血癥，病情迅速進(jìn)展，短期內(nèi)出現(xiàn)多臟器功能不全；1例發(fā)生在移植后18月，以頜下淋巴結(jié)進(jìn)行性腫大局限性起病，EBVDNA檢測(cè)陰性，病程相對(duì)緩和。病理類型6例為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，1例為小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤。7例中4例給予含利妥昔單抗方案治療，2例恢復(fù)，2例死于PTLD進(jìn)展；1例給予供者淋巴細(xì)胞輸注后恢復(fù)；其余2例對(duì)抗病毒對(duì)癥支持治療無(wú)效死亡。結(jié)論P(yáng)TLD是一組異質(zhì)性淋巴細(xì)胞增殖性疾病，盡早診斷，及時(shí)采用有效措施治療有望改善其預(yù)后。

簡(jiǎn)介：目的探討人類免疫缺陷病毒HUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUS，HIV感染者在急性期的臨床特點(diǎn)以及接受抗病毒治療ANTIRETROVIRALTHERAPY，ART48周過(guò)程中的免疫學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答變化，并進(jìn)一步分析艾生特強(qiáng)化治療和雷公藤多甙片TRIPTERYGIUMWILFDIIHOOKF，TWHF對(duì)病毒儲(chǔ)存庫(kù)和免疫激活是否有影響，從而尋找對(duì)急性期HIV感染者的臨床干預(yù)措施，有助于深化對(duì)早期強(qiáng)化治療的認(rèn)識(shí)，并為達(dá)到艾滋病功能性治愈提供一定的理論依據(jù)。方法1橫斷面研究招募44例未接受過(guò)ART的HIV急性期感染者，采集外周靜脈血標(biāo)本，收集臨床流行病學(xué)資料，描述急性期的臨床癥狀，分析CD4T及CD8T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4CD8比值、異常免疫激活、血漿病毒載量、感染途徑、感染時(shí)間等指標(biāo)之間的相關(guān)性。2隊(duì)列研究篩選27例急性期HIV感染者，根據(jù)CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行1∶1匹配原則選取27例慢性期感染者作為對(duì)照，規(guī)律ART并于基線、治療后4、12、24、36、48周進(jìn)行隨訪，觀察啟動(dòng)ART后兩組人群在CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4CD8比值、血漿病毒載量和CD8T細(xì)胞上HLADR、CD38表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)改變。進(jìn)一步將27例急性期HIV感染者根據(jù)接受ART方案的不同分為三個(gè)亞組，第一組為11例患者接受含艾生特RALTEGRAVIR，RAL的ART，并于ART24周時(shí)加用TWHF第二組為10例患者僅接受四聯(lián)強(qiáng)化ART第三組為6例患者接受標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)ART，分別在基線、治療4、8、12、24、36及48周共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行規(guī)律隨訪。觀察三組人群CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、病毒載量及CD8T細(xì)胞上HLADR、CD38表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)改變。3隊(duì)列研究分別從上述隊(duì)列中篩選出16例急性期和慢性期初治HIV感染者，分別檢測(cè)基線、4、12、24及48周共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)PBMC中的HIVDNA的動(dòng)態(tài)變化，并分析與CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿病毒載量及CD8T細(xì)胞上HLADR、CD38表達(dá)水平的相關(guān)性。進(jìn)一步分析TWHF組（6例）、TWHF組（4例）和對(duì)照組（6例）三組人群中急性期感染者在上述5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HIVDNA的動(dòng)態(tài)變化是否有差異。結(jié)果1橫斷面研究44例急性期HIV感染者最常見(jiàn)的癥狀和體征包括發(fā)熱28例636％、頸部淋巴結(jié)腫大23例523％、皮膚黏膜損害8例182％、腹瀉9例205％、咽痛、咳嗽各4例91％等少見(jiàn)首診癥狀和體征包括1例23％格林巴利綜合征、1例23％上臂蜂窩織炎、1例23％頭痛嘔吐、1例23％肛周膿腫、1例23％血小板減少。其中7例159％患者無(wú)明顯癥狀。其中32例患者727％可以明確具體感染時(shí)間，平均為85IQR51，118天，25例568％出現(xiàn)了淋巴細(xì)胞比例升高，CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)為413ULIQR359UL，620UL，CD8T細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)1521ULIQR1054UL，2226UL，最大值高達(dá)7984UL，CD4CD8平均為029015，037，其中42例955％患者呈現(xiàn)明顯的倒置現(xiàn)象。血漿病毒載量中位數(shù)為489LG拷貝MLIQR459LG拷貝ML，543LG拷貝ML。CD8T細(xì)胞表面的HLADR和CD38表達(dá)比例分別為744％±162％和847％±125％。CD4T細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系R049，P0001，CD8T細(xì)胞的HLADR和CD38表達(dá)比例與血漿病毒載量有顯著的正相關(guān)趨勢(shì)R043，P0005R050P00008。2隊(duì)列研究27例急性期和27例慢性期HIV感染者經(jīng)過(guò)48周ART，血漿病毒載量分別降低了368LG拷貝ML和332LG拷貝ML，兩組CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)分別增長(zhǎng)了223UL和121ULP0032，CD8T細(xì)胞計(jì)數(shù)分別減少1102UL和271ULP0004。ART48周時(shí)，兩組CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)及比例、CD8T細(xì)胞計(jì)數(shù)及比例和CD4CD8比值大于1的患者所占的比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。兩組CD8T細(xì)胞的HLADR表達(dá)比例分別降低489％和354％，CD38表達(dá)比例分別降低451％和223％，發(fā)現(xiàn)AHI組的CD38表達(dá)比例變化量明顯高于CHI組P0006，而兩組的HLADR表達(dá)比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0081。在TWHF組、TWHF組和對(duì)照組中，強(qiáng)化治療組的血漿病毒載量的下降速率明顯快于對(duì)照組P0019，CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)在48周內(nèi)的變化量分別151UL、227UL、193ULP057，CD8T細(xì)胞計(jì)數(shù)變化量分別為1527UL、1112UL1550ULP074，三組人群之間HLADR和CD38表達(dá)比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。3隊(duì)列研究基線時(shí)，AHI組和CHI組PBMC中HIVDNA分別為211181，245和222205，254LG拷貝106PBMC，P057，CHI組HIVDNA與血漿病毒載量呈顯著正相關(guān)關(guān)系P0026，R005，AHI組未發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關(guān)性。規(guī)律ART后，兩組人群平均HIVDNA含量均呈下降趨勢(shì)，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間亦無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。治療48周時(shí)，TWHF組、TWHF組和對(duì)照組的HIVDNA分別為117006，125、177086，208和111038，135拷貝106PBMC，三組人群之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論HIV急性期感染者常見(jiàn)臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、頸部淋巴結(jié)腫大、皮疹及腹瀉CD8T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，CD4CD8倒置明顯和異常升高免疫激活是急性期的特征性表現(xiàn)，病毒載量和T細(xì)胞激活亞群檢測(cè)，尤其是CD4CD8比值有助于早期診斷急性期HIV感染。相比慢性期，對(duì)急性期HIV感染者進(jìn)行早期ART治療，不僅可以早期將病毒載量控制在檢測(cè)下限以下，而且可以更顯著降低CD8T上CD38和HLADR的表達(dá)，艾生特強(qiáng)化治療可以快速降低病毒載量，但不能影響機(jī)體的免疫學(xué)的應(yīng)答。從病毒儲(chǔ)存庫(kù)方面分析發(fā)現(xiàn)，病毒儲(chǔ)存庫(kù)在急性期的早期即開(kāi)始建立，急性期和慢性期病毒載量和HIVDNA在治療后衰減呈正相關(guān)，說(shuō)明任何階段抗病毒治療都可以起到減少病毒儲(chǔ)藏庫(kù)的作用。急性期患者接受雷公藤多甙聯(lián)合艾生特強(qiáng)化治療48周，觀測(cè)到PBMC中HIV1DNA的含量呈降低的變化趨勢(shì)。

簡(jiǎn)介：目的研究維持性血液透析患者丙型肝炎病毒HCV感染的血清學(xué)診斷方法探討抗HCV聯(lián)合HCVRNA檢測(cè)在維持性血液透析患者HCV感染早期診斷中的意義以期獲得維持性血液透析患者HCV感染早期診斷的可靠方法并明確深圳市第二人民醫(yī)院血液透析中心患者丙型肝炎病毒感染的現(xiàn)況。方法選擇深圳市第二人民醫(yī)院血液透析中心183例維持性血液透析患者為研究對(duì)象分別使用不同HCV抗體試劑盒檢測(cè)抗HCV使用TMA法定性檢測(cè)HCVRNA熒光定量PCR法定量檢測(cè)HCVRNA比較不同產(chǎn)品及診斷方法對(duì)HCV的檢出率評(píng)價(jià)ALT變化與HCVRNA載量以及抗HCVSCO值與HCVRNA載量的關(guān)系。結(jié)果兩種不同產(chǎn)品國(guó)產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑對(duì)抗HCV檢測(cè)結(jié)果一致在本中心183例維持性血液透析患者中檢出抗HCV陽(yáng)性患者13例檢出率為71％兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P1000TMA法定性檢測(cè)HCVRNA陽(yáng)性16例檢出率為87而免疫熒光定量PCR法檢測(cè)HCVRNA陽(yáng)性10例檢出率為55兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Χ287537P0000HCVRNA定性檢測(cè)比檢測(cè)抗HCV的檢出率高兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Χ281531P0000聯(lián)合檢測(cè)抗HCV和HCVRNA定性檢測(cè)結(jié)果HCV陽(yáng)性共19例檢出率為104與單獨(dú)檢測(cè)抗HCVP0031相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但與單獨(dú)定性檢測(cè)HCVRNAP0250比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HCVRNA的載量和ALT的變化無(wú)相關(guān)性R0189P0536抗HCV初篩的SCO值與HCVRNA載量無(wú)相關(guān)性R0174P0569。深圳市第二人民醫(yī)院血液透析中心患者丙型肝炎病毒感染率為104高于獻(xiàn)血人群Χ218857P0000。結(jié)論本研究結(jié)果顯示HCVRNA定性檢測(cè)較抗HCV檢測(cè)能縮短維持性血液透析患者HCV感染后檢出的“窗口期”有利于早期診斷。HCVRNA定性檢測(cè)能較臨床現(xiàn)行的HCVRNA免疫熒光定量檢測(cè)顯著提高HCV感染的檢出率。聯(lián)合檢測(cè)抗HCV及HCVRNA定性檢測(cè)既能縮短HCV感染檢出的“窗口期”也能顯著提高HCV感染的檢出率可避免漏檢處于血清轉(zhuǎn)換期或慢性病毒攜帶或既往感染的“隱性”患者值得臨床推廣應(yīng)用。ALT的變化和HCV載量無(wú)明顯相關(guān)性在血液透析患者中輔助早期診斷HCV感染的作用較小。

簡(jiǎn)介：河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)性癲癇大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制探討及尼莫地平的影響姓名王佩申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師王維平20080401英文縮寫(xiě)EDTAEEGENEPSPFCMGABAG1UHFSLTDL阻MAPKKNMDNMDAPBSPMSFPKAETHYLENEDIAMINETETRAACETIC乙二胺四乙酸ELECTROENCEPHALOGRAM腦電圖ERRORNUMBER錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)EXCITATORYPOSTSYNAPTISPOTENTIALS興奮性突觸后電位FLOWCYTOMETRY流式細(xì)胞術(shù)GAMAAMINOBUTYRICACIDY氨基丁酸GLUTAMICACID谷氨酸HIGHFREQUENCYSTIMULATION高頻刺激LONGTERMDEPRESSION長(zhǎng)時(shí)程抑制LONGTERMPOTENTIATION長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEKINASE有絲分裂原活性蛋白激酶激酶NIMODIPINE尼莫地平NMETHYLDASPARTICN甲基D天門(mén)冬氨酸PHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液PHENYLMETHYLSULFONYLFLUORIDE苯甲基磺酰氟PROTEINKINASEA2L

簡(jiǎn)介：華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文自我的社會(huì)認(rèn)知與自我成長(zhǎng)團(tuán)體姓名呂建國(guó)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)基礎(chǔ)心理學(xué)指導(dǎo)教師俞文釗200051ABSTRACTFROMTHEFUNDAMENTALVIEWPOINTTHATTHESELFGROWSINTHEINTERACTIONBETWEENINDIVIDUALANDCOLLECTIVEACLOSERLOOKISTAKENATTHEJNTERACTIVECONTEXTANDTHESOCIALCOGNITIONOFTHESELFINTHESELFGROWTHGROUPANDACCORDINGTOTHEIDEAOFTHEJNTERNALIZATIONOFTHESOCIALCOGNITIVESTRUCTUREINSELFGROWTHAPROPOSESRAISEDTOMAKESUREOFTHEPOSSIBILITYANDNECESSARYCONDITIONTOADAPTGROUPINTERVENTIONSOFFACILITATINGSELFGROWTHTHROUGHTHESOCIALCOGNITIONSTRUCTUREIMPROVEMENTTHROUGHASETOFFIELDSTUDY，MANAGINGTHESOCIALSELECTINGSITUATIONANDCONFLICTINGFEEDBACKITISFOUNDTHATTHESUBJECTS’WORKINGSEIFCONCEPTMAYCHANGEINTHESITUATIONOFHIGHAROUSALANDHIGHINCONSISTENCYANDTHECHANGEDSELFCONCEPTMAYTAKEPARTINTHEGUIDANCEANDADJUSTMENTOFTHESOCIAICOGNITIONOFTHESELFITISDEMONSTRATETHATINCASETHEINDIVIDUALISTHREATENEDBYTHECONFLICTSITUATIONTHECOLLECTIVESELFMAY10WDOWNINTHECHANGESMENTIONEDABOVESEXDIFFERENCEISANACTIVEMEDIUMFACTORINTHEANALYSISOFTHEDIFFERENTTYPESOFRECEIVINGCONFLICTFEEDBACKITISFOUNDTHATTHEREEISTSTHETENSIONSYSTEMANDTHETENSIONINFLUENCESTHESELFDESCRIPTIONBOMININDIVIDUALSELFANDCOLLECTIVESELGINTHEMUTUAICONSTRUCTIVECOGNITIONFRAMEWORK，CONNECTEDTHESOCIALCOGNITIVETHEORIESOFTHESEL￡AMODELOFMUTUALCONSTRUCTIONINSELFGROWTHISPROPOSEDUNDERTHISMODEL，THE5STEPSOFTHEGROUPPROCESSORIENTATION，OPENNESS，EXPLORATION，RESPONSLBILITYANDINTEGRATION；THE5PRINCIPLESFOROPERATIONPROGRESSIVEORIENTATION，SITUATIONHIGHLIGHT，COGNITIVETENSION，COHORTCOMPOSITIONANDAUTOSELECTION，ARECLEARLYEXPRESSEDINTHECASESTUDYANDINTHETRAININGPROGRAM“THESELFGROWTHILAND”THEPRACTICEOFTHEGROWTHGROUPWASORIGINATEDFROMLEWINIANTGROUPDURING40STHISCENTURYASTHEEARLIESTTYPEOFLEARNINGGROUP，ITWASTHECOMPONENTOFORGANIZATIONDEVELOPMENTLEDBYLEWINANDITHASTHEBASICAIMTOIMPROVEMANAGERSSKILLSOFINTERPERSONALCOMMUNICATION，TOFACILITATEINDIVIDUALGROWTHANDORGANIZATIONALGROWTH，ANDFINALLYTOIMPROVETHEPERFORMANCEOFTHEWHOLEORGANIZATIONTHROUGHTHETHEORETICALANDAPPLICATIVESTUDY，THISRESEARCHOFFERSABENEFICIALFRAMEWORKTOPERSONNELTRAININGIN‘HUMANCENTERED”MANAGEMENTKEYWORDSSOCIALCOGNITIONOFTHESELFSELFGROWTHGROUP，SELFCONCEPT，HUMANCENTEREDMANAGEMENT，GROUPINTERVENTION

簡(jiǎn)介：背景現(xiàn)有治療性HPV疫苗在宮頸癌人類臨床試驗(yàn)中缺乏顯著療效。增強(qiáng)腫瘤抗原特異的殺傷效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答是提升疫苗效果的重要策略。病毒樣顆粒VLPS在激發(fā)體液免疫中己證明具有高度免疫原性，是理想的疫苗載體。目的本研究擬探討以VLPS形式呈遞HPVCTLS抗原肽，考察激發(fā)的特異細(xì)胞免疫應(yīng)答以及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的干預(yù)，以揭示VLPS作為治療型疫苗載體的應(yīng)用潛能，并提供候選治療性HPV疫苗。方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇小鼠中證明有效的4個(gè)HPV16E6、E7CTLS表位，經(jīng)基因重組將其DNA片段克隆于乙肝核心抗原HBCAG優(yōu)勢(shì)抗原表位。重組蛋白在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，以硫酸銨鹽析法和蔗糖密度梯度離心純化，并經(jīng)高效液相凝膠過(guò)濾色譜和電鏡進(jìn)行分析鑒定。制備的VLPS以預(yù)防性和治療性策略分別對(duì)小鼠TC1細(xì)胞移植腫瘤進(jìn)行免疫干預(yù)。研究檢測(cè)了小鼠腫瘤大小變化脾細(xì)胞分離后經(jīng)特異抗原肽刺激，以ELISA檢測(cè)IFNΓ表達(dá)，以ELISPOT檢測(cè)分泌IFNΓ的淋巴細(xì)胞，并以流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)CD8IFNΓ細(xì)胞此外，本研究還評(píng)價(jià)了VLPS疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫記憶，探討了體內(nèi)預(yù)存的抗載體抗體、VLPS結(jié)構(gòu)、免疫途徑等因素對(duì)抗原特異治療性VLPS疫苗免疫的影響。結(jié)果重組蛋白在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，純化的蛋白主要以VLPS形式存在基于E74957表位的VLPS以預(yù)防性策略免疫小鼠后，完全抑制了移植腫瘤的生長(zhǎng)在治療性策略中，VLPS顯著抑制了23MM腫瘤的增長(zhǎng)，對(duì)于56MM甚至更大的腫瘤（89MM），VLPS疫苗免疫同樣顯示了明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用此外，VLPS疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生了有效的免疫記憶應(yīng)答，最少可持續(xù)15周機(jī)體預(yù)存的抗載體抗體對(duì)VLPS疫苗發(fā)揮作用無(wú)顯著影響抗原肽體外刺激脾細(xì)胞，結(jié)果顯示疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞具有增強(qiáng)的IFNΓ表達(dá)，提高的分泌IFNΓ的淋巴細(xì)胞水平，以及增加的小鼠體內(nèi)CD8IFNΓ細(xì)胞數(shù)目。結(jié)論呈遞HPVE7CTLS表位的VLPS疫苗能夠激發(fā)持續(xù)有效的E7特異細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，有希望作為候選治療性HPV疫苗，同時(shí)，HBCAGVLPS是有應(yīng)用潛能的治療性疫苗載體。

簡(jiǎn)介：自從1954年首次成功在孿生子問(wèn)進(jìn)行腎移植以來(lái)，經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)的不懈努力，腎移植技術(shù)已從探索走向成熟。近年來(lái)，由于技術(shù)的改進(jìn)，對(duì)免疫學(xué)認(rèn)識(shí)的深入以及強(qiáng)有力免疫抑制劑的問(wèn)世，患者的近中期生存率及生活質(zhì)量已有極大的改善，1年尸腎存活率已達(dá)96％，5年腎存活率達(dá)80％。但是器官移植后受者的人類巨細(xì)胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUSHCMV感染仍然是導(dǎo)致移植后患者死亡的主要原因之一。移植術(shù)后CMV肺部感染發(fā)生率為20％～70％，且15％～35％為有癥狀的CMV病，典型的CMV肺部感染多發(fā)生于移植術(shù)后1～6個(gè)月內(nèi)。CMV在全世界成人中感染率為60％～100％，多為潛伏性感染，機(jī)體表現(xiàn)為持續(xù)血清學(xué)陽(yáng)性即抗CMV抗體IGG陽(yáng)性。當(dāng)免疫功能下降、特別是細(xì)胞免疫力低下時(shí)，機(jī)體又可新感染CMV，或潛伏的病毒再次激活、復(fù)制，形成活動(dòng)性CMV感染，重者則發(fā)生明顯的“CMV病”，在這種情況下，CMV常與其他病原體使免疫功能低下者發(fā)生二重或多重感染，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。CMV肺部感染被認(rèn)為不僅是器官移植術(shù)后近期死亡的重要原因，而且還可能與急性排斥反應(yīng)和慢性移植物失功有關(guān)。如能早期診斷活動(dòng)性CMV感染，并及時(shí)給予抗病毒治療可有效改善免疫受抑制和免疫缺陷病人活動(dòng)性HCMV感染的癥狀，降低其疾病的嚴(yán)重性和死亡率。因此，在監(jiān)測(cè)CMV易感病人時(shí)，應(yīng)及早而準(zhǔn)確地把握病人是否發(fā)生活動(dòng)性HCMV感染，這樣才能及時(shí)治療活動(dòng)性感染的病人，又使未發(fā)生活動(dòng)性感染的病人免受抗病毒藥的毒性損害。第一部分建立NASBBA法檢測(cè)即刻早期核糖核酸的實(shí)驗(yàn)條件及在器官移植后巨細(xì)胞病毒感染診斷中的初步實(shí)驗(yàn)研究目的器官移植術(shù)后CMV感染是導(dǎo)致移植后患者死亡的主要原因之一，因而早期、快速而準(zhǔn)確地診斷CMV活動(dòng)性感染已成為監(jiān)測(cè)CMV感染狀況、及時(shí)給予抗病毒治療以及判斷預(yù)后的關(guān)鍵。關(guān)于CMV的診斷方法很多，如病毒包涵體檢查、病毒分離培養(yǎng)、血清抗體檢測(cè)及DNA聚合酶反應(yīng)PCR、CMV抗原血癥的檢測(cè)等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但是存在一個(gè)共同的不足之處，即無(wú)法區(qū)分CMV潛伏性感染和活動(dòng)性感染。隨著對(duì)CMV基因組的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)即刻早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和病毒復(fù)制緊密相連，由此提出檢測(cè)病毒MRNA是快速診斷CMV活動(dòng)性感染的一項(xiàng)黃金指標(biāo)。近年來(lái)，應(yīng)用核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增NUCLEICACIDSEQUENCEBASEDAMPLIFICATION，NASBA技術(shù)檢測(cè)病毒RNA得到了快速發(fā)展。NASBA法檢測(cè)RNA是一項(xiàng)引物依賴性的核酸技術(shù)，我院自2000年1月始采用該法測(cè)定PP67MRNA用于移植術(shù)后CMV活動(dòng)性感染的臨床診斷，取得了許多經(jīng)驗(yàn)，PP67MRNA檢測(cè)雖然特異性高，但敏感度低，而且陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)間較晚等缺點(diǎn)，不能滿足臨床的需要。為了尋求更好的檢測(cè)指標(biāo)，于2004年1月，我們建立了應(yīng)用NASBA法檢測(cè)即刻早期核糖核酸IMMEDIATEEARLYMRNA，IEMRNA的實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)合臨床實(shí)際，并與PP67和抗原血癥檢測(cè)相比較。方法病例為我院2004年1月～2004年6月接受器官移植的患者，共42例，腎移植25例，肝移植13例，骨髓移植4例。術(shù)后每周抽抗凝血一次至術(shù)后3個(gè)月。首先建立NASBA法檢測(cè)LEMRNA的實(shí)驗(yàn)條件及相關(guān)試劑的合成。采用NASBA法檢測(cè)IEMRNA、PP67MRNA，同時(shí)進(jìn)行免疫組化ENVISIONTM二步法檢測(cè)PP65抗原血癥。所有患者均采用PREDMMFCSAFK506三聯(lián)免疫抑制治療。術(shù)后采用普遍性預(yù)防抗病毒治療方案，給予丙氧鳥(niǎo)苷25～5MGKG1D1，分2次靜脈滴注，共2周。如患者發(fā)生CMV病則丙氧鳥(niǎo)苷劑量加倍。20例健康成人的血標(biāo)本作為陰性對(duì)照。結(jié)果42例器官移植術(shù)后患者共收集了134份外周血標(biāo)本，分別進(jìn)行了PP65抗原、PP67MRNA及IEMRNA的檢測(cè)，有2份標(biāo)本擴(kuò)增野生型MRNA及SCMRNA失敗，視為無(wú)效，有效標(biāo)本數(shù)實(shí)為132份。36份抗原血癥陽(yáng)性≥1個(gè)5萬(wàn)PMNL標(biāo)本中有25份IEMRNA同時(shí)陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率為694％；13份PP67MRNA陽(yáng)性標(biāo)本中有11份IEMRNA陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率為846％。42例移植術(shù)后患者中，檢出PP65抗原陽(yáng)性≥1個(gè)5萬(wàn)PMNL25例陽(yáng)性檢出率595％，PP67MRNA陽(yáng)性11例陽(yáng)性檢出率262％，IEMRNA陽(yáng)性16例陽(yáng)性檢出率381％。發(fā)生有癥狀的活動(dòng)性CMV感染CMV病11例，其中抗原陽(yáng)性8例，PP67MRNA陽(yáng)性6例，IEMRNA陽(yáng)性10例。IEMRNA的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為909％、806％、625％和961％。結(jié)論1NASBA法檢測(cè)CMVMRNA具有便捷、快速、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，特異性高，假陽(yáng)性率低。2PP67MRNA的檢出對(duì)疾病診斷具有高的特異性，但敏感度低，不適于作為移植后先發(fā)制人抗病毒治療方案的依據(jù)，可以作為一個(gè)判斷預(yù)后的指標(biāo)。3IEMRNA的檢測(cè)具有較理想的敏感性和特異度，IEMRNA能夠更好的反映CMV活動(dòng)性感染的狀況，是病毒活動(dòng)性感染的早期診斷指標(biāo)。第二部分NASBA法檢測(cè)即刻早期核糖核酸在腎移植后巨細(xì)胞病毒感染診斷和指導(dǎo)治療中的意義研究目的目前腎移植后抗CMV病的重點(diǎn)是預(yù)防，包括普遍性預(yù)防抗病毒治療和先發(fā)制人PREEMPTIVETHERAPY治療。普遍性預(yù)防治療會(huì)給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和加重的藥物毒性問(wèn)題，先發(fā)制人的抗病毒治療方案，可以減少治療的費(fèi)用與藥物毒性而又不會(huì)延誤治療，早期檢測(cè)到活動(dòng)性CMV感染是先發(fā)制人方案的先決條件。為了準(zhǔn)確地把握好臨床的用藥時(shí)機(jī)，準(zhǔn)確地開(kāi)始和終止用藥，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失和藥物毒負(fù)作用等，這就要求實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能夠早期、快速、準(zhǔn)確可靠反映HCMV的活動(dòng)狀況，同時(shí)能夠動(dòng)態(tài)地檢測(cè)CMV在受者體內(nèi)的活動(dòng)變化。在此前提下，我們對(duì)腎移植術(shù)后55例患者的CMVLEMRNA、PP67MRNA、PP65抗原以及血清學(xué)抗體進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)合抗病毒治療，尋找一種可用于先發(fā)制人抗病毒治療方案的最佳指標(biāo)。方法病例選自我院接受腎移植的患者，共55例，術(shù)前所有供者和受者均采取不抗凝血標(biāo)本，用ELISA檢測(cè)CMVIGG和IGM抗體。術(shù)后每周抽EDTA抗凝血一次共3個(gè)月，分別采用NASBA法檢測(cè)IEMRNA、PP67MRNA和免疫組化ENVISIONTM二步法檢測(cè)PP65抗原血癥。均采用PREDMMFCSAFK506三聯(lián)免疫抑制治療，發(fā)生急性排斥反應(yīng)者給予MP沖擊治療3～5天，無(wú)效者改用ATG或OKT3。初次檢出任何一項(xiàng)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)靜脈給予丙氧鳥(niǎo)苷25～5MGKG1D1，直至轉(zhuǎn)陰后繼續(xù)治療7～14天。發(fā)現(xiàn)CMV病時(shí)丙氧鳥(niǎo)苷劑量加倍，治療無(wú)效或出現(xiàn)毒副作用如白細(xì)胞、血小板低下時(shí)改用磷甲酸鈉。結(jié)果1術(shù)前血清學(xué)狀況及術(shù)后CMV病感染率術(shù)前供者LGG抗體陽(yáng)性者15例，接受陽(yáng)性供體的受者7例為IGG陽(yáng)性，8例為IGG陰性。接受供者IGG抗體陽(yáng)性腎臟患者的感染率明顯高于陰性者。2CMV抗原指數(shù)檢測(cè)結(jié)果55例患者術(shù)后出現(xiàn)抗原陽(yáng)性29例527％，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為20～6055萬(wàn)PMNL，平均1235萬(wàn)PMNL，其中＞10個(gè)5萬(wàn)PMNL者17例，＞20個(gè)5萬(wàn)PMNL者5例。觀察期內(nèi)術(shù)后半年內(nèi)發(fā)生有癥狀的活動(dòng)性CMV感染CMV病13例。發(fā)生CMV病者的平均抗原指數(shù)高于非CMV病患者。IEMRNA陽(yáng)性患者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。3IEMRNA、PP67MRNA及抗原血癥診斷指標(biāo)比較55例患者中，PP65抗原血癥陽(yáng)性29例527％，PP67MRNA陽(yáng)性14例254％，IEMRNA陽(yáng)性20例364％。發(fā)生有CMV病13例，均接受了更昔洛韋治療，10例治療后檢測(cè)結(jié)果陰轉(zhuǎn)，同時(shí)癥狀消失。有2例出現(xiàn)ARDS，其中1例因呼吸衰竭死亡。IEMRNA的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為923％、809％、600％和971％。4三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化LEMRNA首次檢出平均時(shí)間31O±154天，早于PP67MRNA437±163和PP65抗原血癥396±156天。而PP67MRNA的平均陰轉(zhuǎn)時(shí)間早于其他兩項(xiàng)。結(jié)論1腎移植術(shù)前病人的CMV血清學(xué)狀況無(wú)論是陽(yáng)性還是陰性，如果接受CMV陽(yáng)性供者的腎臟，則術(shù)后感染發(fā)生率明顯高于接受CMV陰性供者腎臟的病人。2CMV病患者的平均抗原指數(shù)水平高于非CMV病者，說(shuō)明抗原指數(shù)與CMV感染的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系。但某些抗原指數(shù)高者可能并無(wú)臨床癥狀，而低抗原指數(shù)者也有可能出現(xiàn)明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)。IEMRNA陽(yáng)性者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。3IEMRNA具有相對(duì)合適的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，IEMRNA的檢測(cè)能夠更好的反映CMV活動(dòng)性感染的狀況。而PP67具有較高的特異性，陽(yáng)性結(jié)果代表了CMV病已經(jīng)到了嚴(yán)重程度，對(duì)判斷預(yù)后有一定的意義。4IEMRNA首次檢出的平均時(shí)間早于PP67MRNA和PP65抗原血癥。而PP67MRNA的平均陰轉(zhuǎn)時(shí)間早于其他兩項(xiàng)。LEMRNA檢出時(shí)間早有利于掌握最佳用藥時(shí)機(jī)，防止了病情的延誤，使患者得到及時(shí)的治療。

簡(jiǎn)介：目的觀察咳喘寧防治病毒誘發(fā)小兒哮喘的臨床療效，并通過(guò)觀察咳喘寧對(duì)患兒病毒感染階段TH亞群細(xì)胞因子表達(dá)的影響，闡明其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理，為哮喘病的防治提供理論與實(shí)踐依據(jù)。方法采用隨機(jī)、單盲、對(duì)照的方法，將120例病毒誘發(fā)哮喘患兒隨機(jī)分為咳喘寧治療組60例和西藥對(duì)照組60例，觀察7天后臨床癥狀積分的改變。采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)患兒血清中TH1型細(xì)胞因子IL12與TH2型細(xì)胞因子IL4的含量，并分析其治療前后的變化。結(jié)果1咳喘寧治療組無(wú)論是總有效率還是臨床控制率，均明顯優(yōu)于對(duì)照組，其在改善噴嚏、流涕、咳嗽、咯痰等方面效果更明顯。2咳喘寧的療效與患兒性別、病程無(wú)關(guān)，但與患兒年齡有關(guān)，年齡越小，療效越好。3病毒誘發(fā)哮喘患兒血清TH1型細(xì)胞因子IL12水平降低，TH2型細(xì)胞因子IL4及外周血嗜酸性粒細(xì)胞EOS水平升高，IL12與IL4水平成負(fù)相關(guān)，IL4與EOS水平呈正相關(guān)，IL12與EOS水平呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明患兒TH1TH2型細(xì)胞因子水平處于失衡狀態(tài)?？却瓕幠茱@著提高患兒血中IL12，降低IL4，從而對(duì)病毒誘發(fā)哮喘患兒TH亞群產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，其作用明顯優(yōu)于對(duì)照組?？却瓕幠苊黠@降低患兒外周血EOS水平，其作用比對(duì)照組更明顯。結(jié)論咳喘寧防治病毒誘發(fā)小兒哮喘具有較好療效，其作用機(jī)制與提高患兒IL12水平，降低IL4與EOS水平有關(guān)。

簡(jiǎn)介：目的1、應(yīng)用HBV復(fù)制小鼠模型研究MIFNΑ不同亞型對(duì)HBV的抗病毒效果。2、探索MIFNΑ不同亞型的抗HBV作用機(jī)制。3、為揭示臨床IFNΑ治療HBV慢性感染患者應(yīng)答不佳的分子機(jī)制及探索新的HBV治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1、尾靜脈高壓水注射PAAVHBV12質(zhì)粒于BALBC建立HBV復(fù)制小鼠模型在注射質(zhì)粒的前1天至注射后第8天每天腹腔注射MIFNΑ1、Α2、Α4、Α5、Α6、Α9、Α11重組蛋白僅注射生理鹽水組小鼠作為對(duì)照。2、注射質(zhì)粒后1、4、7、10天內(nèi)眥靜脈取血ELISA檢測(cè)血清HBSAG、HBEAG、HBSAB、HBEAB和HBCAB定量PCR檢測(cè)HBVDNA水平第4天和10天每組處死35只小鼠取肝組織免疫組化檢測(cè)肝內(nèi)HBCAG表達(dá)水平定量PCR檢測(cè)肝內(nèi)HBVDNA水平以及干擾素刺激基因OAS和PKR的MRNA水平。3、GRAPHPADPRISM5軟件作圖SPSS170對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為方差分析P結(jié)果1、在HBV復(fù)制小鼠模型中MIFNΑ5對(duì)血清HBSAG、HBEAG和HBVDNA的抑制效果最明顯MIFNΑ11的抑制效果最弱2、MIFNΑ處理組小鼠血清中HBSAB、HBEAB和HBCAB的表達(dá)均無(wú)明顯變化3、在HBV復(fù)制小鼠模型中MIFNΑ5對(duì)肝組織內(nèi)HBCAG的表達(dá)以及HBVDNA的復(fù)制抑制效果最明顯MIFNΑ11的抑制效果最弱4、MIFNΑ4、Α5處理組OASMRNA水平與HBVDNA水平成負(fù)相關(guān)其它處理組無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論1、在HBV復(fù)制小鼠模型中MIFNΑ5對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果最明顯MIFNΑ11的抑制效果最弱。2、不同亞型MIFNΑ抗HBV作用差異的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義本研究表明在HBV復(fù)制小鼠模型中不同MIFNΑ亞型的抗病毒效果存在差異MIFNΑ5抗HBV效果比目前臨床常用的IFNΑ2更明顯本研究為臨床研發(fā)抗HBV感染的新型高效IFNΑ提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：漢坦病毒（HANTAVIRUS）屬于布尼亞病毒科，是一種有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。漢坦病毒主要引起兩種急性傳染病，一種是腎綜合征出血熱（HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROME，HFRS），該病是我國(guó)重點(diǎn)防治的傳染??；另一種是漢坦病毒肺綜合征（HANTAVIRUSPULMONARYSYNDROME，HPS），主要流行于美洲國(guó)家。HFRS是以發(fā)熱、出血和腎功能損害為主要特征的一種急性病毒性傳染病。病毒感染人體后可以侵犯內(nèi)皮細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞，誘生各類細(xì)胞因子的變化，最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂、血管通透性增加等一系列病理改變。但其具體機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。病毒的感染并非是泛嗜性的，每一種病毒通常只能感染某種或某些特定的靶細(xì)胞。通常，病毒由靶細(xì)胞表面的特異分子介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，該分子可作為病毒受體參與病毒的識(shí)別與結(jié)合等過(guò)程。病毒與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合是病毒感染致病的第一步。Β3整合素已確認(rèn)為致病性漢坦病毒的受體，Β3整合素上的PSI結(jié)構(gòu)域（PLEXINSEMAPHIN–INTEGRIN，PSI）是漢坦病毒與整合素相互作用的位點(diǎn)。然而，近年來(lái)有研究報(bào)道，網(wǎng)格蛋白（CLATHRIN）相關(guān)的受體可能介導(dǎo)了漢坦病毒的吸附和入胞過(guò)程，但由于抑制網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用并同時(shí)抑制Β3整合素并不能完全阻斷漢坦病毒的內(nèi)化，因此漢坦病毒很可能還存在其他的內(nèi)化通路。另外，本實(shí)驗(yàn)室前期在應(yīng)用RAS募集（RASRECRUITMENTSYSTEM，RRS）酵母雙雜交系統(tǒng)研究漢坦病毒包膜糖蛋白相互作用分子，尋找病毒受體的研究中發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒包膜糖蛋白G1、G2均可以與纖維連接蛋白（FIBRONECTIN，F(xiàn)N）相互作用。FN是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和肝臟產(chǎn)生的一種多功能蛋白質(zhì)它的合成和降解由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β（TGFΒ）調(diào)節(jié)。研究表明，F(xiàn)N在多種病毒感染過(guò)程中起重要作用，與病毒的入胞過(guò)程和致病過(guò)程密切相關(guān)。那么，漢坦病毒是否還存在著其他入胞途徑FN在漢坦病毒感染過(guò)程中又有什么作用呢是否能輔助病毒入胞，以及是否在漢坦病毒感染致病中起重要作用基于以上疑問(wèn)，圍繞FN進(jìn)行了如下研究1、FN與漢坦病毒核衣殼蛋白及小窩蛋白的共定位研究已知網(wǎng)格蛋白依賴型入胞途徑和小窩蛋白依賴型內(nèi)吞途徑是許多病毒入胞的重要途徑。為了確定漢坦病毒是否可以由FN介導(dǎo)經(jīng)小窩途徑入胞，我們研究了漢坦病毒與FN及小窩蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位關(guān)系。首先基于空斑形成實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用微量細(xì)胞培養(yǎng)法（雙抗夾心ELISA）測(cè)定漢坦病毒的TCID50，對(duì)病毒感染滴度進(jìn)行了滴定。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用共聚焦顯微鏡分別觀察了漢坦病毒感染的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中漢坦病毒與FN和小窩蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞水平的共定位關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢坦病毒NP與FN和小窩蛋白可以共定位于HUVEC的細(xì)胞膜和細(xì)胞核周區(qū)域從而說(shuō)明了漢坦病毒的入胞途徑除了可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴的入胞途徑外，可能還可通過(guò)FN介導(dǎo)的小窩蛋白途徑進(jìn)入細(xì)胞。2、不同F(xiàn)N片段對(duì)漢坦病毒感染的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)為進(jìn)一步明確FN分子在漢坦病毒感染中的作用，我們應(yīng)用5種FN片段進(jìn)行了漢坦病毒感染競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，以確定FN分子中的哪個(gè)結(jié)構(gòu)片段或者哪種形式在漢坦病毒感染過(guò)程中起作用。具體方法是采用重組全長(zhǎng)FN、細(xì)胞結(jié)合片段、連接區(qū)片段、鉸鏈區(qū)片段、硫酸肝素結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)抑制漢坦病毒感染敏感細(xì)胞HUVEC。用ELISA試驗(yàn)分別檢測(cè)病毒抗原，結(jié)果表明，5種FN片段無(wú)論加入的濃度高低，對(duì)漢坦病毒的感染均有一定的抑制作用。特別是40KDA的連接區(qū)片段對(duì)漢坦病毒感染的抑制作用具有濃度依賴性，即隨著其濃度的增加病毒的載量也漸次減低。其余4種片段對(duì)漢坦病毒感染的阻抑作用并未隨著加入片段的濃度升高而增強(qiáng)，因此其阻抑病毒感染的作用可能具有非特異性。3、腎綜合征出血熱患者不同病期外周血FN及TGFΒ1的動(dòng)態(tài)變化為探求FN及其相關(guān)因子TGFΒ1在漢坦病毒致病中的作用，共采集了HFRS患者不同病期的血清、血漿樣本各260份，以及正常人血樣30份。首先應(yīng)用WESTERNBLOT檢測(cè)到HFRS患者血清中含有FN；繼而應(yīng)用ELISA法對(duì)HFRS患者及健康人血清、血漿中FN及其相關(guān)細(xì)胞因子TGFΒ1進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFRS患者不同病期血漿中FN水平隨病期的推移呈波動(dòng)升高趨勢(shì)，其中發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期患者血漿中FN水平均低于正常對(duì)照組。多尿期、恢復(fù)期血漿中FN水平均高于正常對(duì)照組（P綜上所述，在漢坦病毒感染過(guò)程中，F(xiàn)N有可能起到多種作用。在漢坦病毒感染時(shí)，病毒可能通過(guò)由組織型FN介導(dǎo)的小窩途徑入胞，且其FN連接區(qū)部位可能起到關(guān)鍵作用。同時(shí)，TGFΒ1與HFRS患者體內(nèi)FN的關(guān)系還有待進(jìn)一步的探討。本研究結(jié)果為進(jìn)一步從分子水平上闡明漢坦病毒的入胞和致病機(jī)制提供了新的線索和依據(jù)。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)R3密級(jí)單位代碼學(xué)號(hào)1031220121004南京醫(yī)斜犬掌碩士學(xué)位論文題學(xué)科專業(yè)生理堂學(xué)院名稱直京醫(yī)型太堂基趟醫(yī)堂院目錄中文摘要LABSTRACT6第一部分SEIPIN缺失對(duì)情緒行為的影響及其性別差異13前言1。3一日Ⅱ舌材料和方法15結(jié)果22討論30參考文獻(xiàn)34第二部分SEIPIN缺失對(duì)認(rèn)知行為的影響及其分子機(jī)制研究38前言38月O舌J芍材料和方法39結(jié)果46討念54參考文獻(xiàn)一58綜述一62英文縮寫(xiě)及中英文全名對(duì)照表74攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況75致謝78

簡(jiǎn)介：目的；構(gòu)建漢坦病毒HANTAVIRUS，HV莒南擴(kuò)增株JUN05株核衣殼蛋白NUCLEOCAPSIDPROTEIN，NP的熒光蛋白表達(dá)載體；將HVNP基因與EGFP基因在BHK21細(xì)胞中融合表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，以及融合蛋白在細(xì)胞中定位和分布，免疫組化觀察融合蛋白的免疫反應(yīng)性，從而為新型HV診斷試劑研制與開(kāi)發(fā)，以及NP結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定基礎(chǔ)。方法；根據(jù)HV莒南擴(kuò)增株JUN05株NP基因的序列和表達(dá)載體PEGFPN1的多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增NP全基因。PCR產(chǎn)物回收后以核酸內(nèi)切酶BGLⅡ、PSTⅠ雙酶切，克隆至同樣雙酶切的PEGFPN1載體上，并保持NP基因與EGFP基因的讀碼框一致，CACL2法轉(zhuǎn)化并篩選陽(yáng)性克隆。通過(guò)PCR方法和雙酶切方法鑒定，并通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)最終鑒定表達(dá)載體的構(gòu)建情況。將重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后固定細(xì)胞，熒光顯微鏡檢和免疫組化技術(shù)觀察融合蛋白的表達(dá)并拍照記錄。結(jié)果；1構(gòu)建了含有HVNP基因的熒光蛋白表達(dá)載體，酶切鑒定、PCR鑒定、及測(cè)序結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。2測(cè)序結(jié)果表明，NP基因成功連入EGFP基因上游，二者讀碼框一致無(wú)移位，與NP基因在克隆載體中的序列比對(duì)，無(wú)PCR擴(kuò)增導(dǎo)致的堿基突變，并且NP基因末端的終止密碼子TAA被去除。并添加了KOZAK序列，為高效表達(dá)提供了基因水平的改造。3熒光顯微鏡下觀察，NPEGFP融合蛋白在BHK21細(xì)胞中得到高效表達(dá)，細(xì)胞漿內(nèi)充滿了致密的綠色熒光，熒光呈核周分布，達(dá)到了以綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因觀察NP的表達(dá)及定位的目的。免疫組化也出現(xiàn)了陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)論；本次研究利用基因工程技術(shù)成功地構(gòu)建了含有HV莒南擴(kuò)增株JUN05株NP全長(zhǎng)基因的表達(dá)載體PEGFPNP。NP基因成功連入EGFP基因上游，使NP基因位于CMV啟動(dòng)子之下，并添加了KOZAK序列，為高效表達(dá)提供了基因水平的改造。融合蛋白NPEGFP基因在BHK21細(xì)胞中得到了高效表達(dá)，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，表達(dá)的融合蛋白具有NP和EGFP的雙重活性，可用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因觀察NP的表達(dá)及定位，并為進(jìn)一步篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，大量制備純化該蛋白，應(yīng)用于HV的診斷奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文逆轉(zhuǎn)錄病毒中介T(mén)NFΑ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的TIL抗人腦膠質(zhì)瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究姓名關(guān)俊宏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)指導(dǎo)教師陳淑珍200341X109，平均擴(kuò)增274445倍，表明人腦膠質(zhì)瘤TIL體外在IL一2作用下可得到良好的增殖；人腦膠質(zhì)瘤TIL對(duì)TJ8510細(xì)胞殺傷活性與其培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)，7FIL經(jīng)IL一2培養(yǎng)10天，呈現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，但殺傷活性較低，而此時(shí)LAK的殺傷活性明顯高于TIL；當(dāng)培養(yǎng)20天時(shí)TIL殺傷活性迅速增加，而LAK殺傷活性迅速下降，兩者差異顯著；30天時(shí)TIL殺傷活性處于高峰，而LAK殺傷活性繼續(xù)下降。提示人腦膠質(zhì)瘤TIL對(duì)IL一2反應(yīng)遲鈍，活化潛伏期長(zhǎng)，而LAK細(xì)胞則相反，TIL體外抗瘤活性與增殖能力相關(guān)。2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)前后，細(xì)胞的增殖情況未受到明顯影響，證明逆轉(zhuǎn)錄病毒中介的基因轉(zhuǎn)移并不影響宿主細(xì)胞自身的功能，TIL完全符合基因治療中運(yùn)載細(xì)胞的要求；對(duì)TNFA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的TIL細(xì)胞TNFA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果顯示TNFTIL細(xì)胞TNFD的分泌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)TIL細(xì)胞和NEOR一‘FIL細(xì)胞；TNFTIL細(xì)胞表達(dá)TNFD的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果TNFTIL細(xì)胞在體外培養(yǎng)30天，可持續(xù)表達(dá)高水平的TNFOL，說(shuō)明導(dǎo)入TNF一0【基因已完整、穩(wěn)定地整合于TIL細(xì)胞基因組中并獲得了表達(dá)。比較TIL、NEOR一7FIL和TNFTIL三者的抗瘤活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)導(dǎo)TNFA基因的‘FIL細(xì)胞對(duì)人腦膠質(zhì)瘤TJ8510細(xì)胞的體外抗瘤活性明顯提高，與TIL和NEORTIL相比差異顯著，我們認(rèn)為這是由于TNFD基因轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL細(xì)胞后，能持續(xù)高水平地分泌內(nèi)源性的TNFD，從而放大了TIL自身的抗瘤活性。3局部轉(zhuǎn)輸TNFTIL和靜脈轉(zhuǎn)輸TNF一耵L均能明顯抑制裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)，且抑瘤效果高于TIL治療組，TIL靜脈轉(zhuǎn)輸元明顯抑瘤效果，說(shuō)明TNF一僅基因轉(zhuǎn)染TIL放大了TIL的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)；而局部轉(zhuǎn)輸TNF一‘RIL較靜脈轉(zhuǎn)輸TNFTIL對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果更為明顯，提示過(guò)繼性免疫治療膠質(zhì)瘤以局部轉(zhuǎn)輸方式為佳。雖然靜脈轉(zhuǎn)輸TNFTIL的治療效果不及局部轉(zhuǎn)輸，但也能抑制人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，與單純靜脈轉(zhuǎn)輸TIL的抑瘤效果差異顯著。我們認(rèn)為其原因可能是①TNFD基因轉(zhuǎn)染后，放大了腫瘤局部TIL的抗瘤效應(yīng)；②血循環(huán)中的TNFTIL分泌的TNF一0【可能在一定程度上發(fā)揮了全身抗腫瘤作用。2

簡(jiǎn)介：I分類號(hào)分類號(hào)密級(jí)密級(jí)UDC學(xué)號(hào)學(xué)號(hào)406211212029南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)慢病毒介導(dǎo)BMPRII基因基因沉默對(duì)人肝癌移植瘤生長(zhǎng)沉默對(duì)人肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響的影響THEEFFECTOFBMPRIIGENESILENCINGONTHEGROWTHOFHUMANHEPATOCELLULARCARCINOMATRANSPLANTATIONTUM王碩培養(yǎng)單位（院、系）南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱吳建兵教授主任醫(yī)師申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門(mén)類醫(yī)學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱腫瘤學(xué)論文答辯日期2015年5月答辯委員會(huì)主席徐方云評(píng)閱人陳麗周存才2015年5月摘要II摘要目的目的探討B(tài)MPRII基因RNA干擾（RNAI）的重組慢病毒載體對(duì)人肝癌HEPG2細(xì)胞裸鼠移植瘤BMPRII基因表達(dá)和移植瘤生長(zhǎng)的影響。方法方法1、前期研究已明確了具有下調(diào)BMPRII基因的SIRNA干擾序列，設(shè)計(jì)并合成SHRNAOLIGO退火后構(gòu)建入干擾慢病毒載體PLSHRNAFBMPRII，用構(gòu)建的慢病毒載體PLSHRNAFBMPRII轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝慢病毒，并用熒光法測(cè)定滴度，用包裝的PLSHRNAFBMPRII干擾慢病毒侵染HEPG2細(xì)胞。2、通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)QRTPCR、蛋白印跡（WESTERNBLOT）技術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中BMPRIIMRNA及蛋白水平表達(dá)的變化，明確處理后BMPRII沉默的效果。3、建立人肝癌HEPG2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。隔天1次向各組動(dòng)物腫瘤內(nèi)分別注射BMPRIISHRNA慢病毒顆粒、攜帶無(wú)效序列的慢病毒顆粒和09氯化鈉溶液02ML，共5次，測(cè)量各組腫瘤體積的大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，13天后處死裸鼠。4、應(yīng)用WESTERNBLOT及免疫組化技術(shù)檢測(cè)移植瘤中BMPRII蛋白水平表達(dá)。結(jié)果結(jié)果1、QRTPCR及WESTERNBOLT檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，BMPRIIMRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組剝脫的瘤體體積分別為（1274613302）MM3和（1255213005）MM3，而實(shí)驗(yàn)組剝脫的瘤體體積為（32868772）MM3