簡(jiǎn)介：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文門診婦女對(duì)宮頸癌篩查、HPV感染及疫苗認(rèn)知程度調(diào)查姓名樊寶劍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)中西醫(yī)結(jié)合臨床指導(dǎo)教師張新20090401

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多132例家族聚集性的慢性乙型肝炎病毒感染者自然病程進(jìn)展與相關(guān)因素的分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：南方醫(yī)科大學(xué)2009級(jí)碩士學(xué)位論文血型B抗原模擬多肽／FAS重組腺病毒對(duì)小鼠4TI乳腺癌影響的實(shí)驗(yàn)研究THEINFLUENCEOFRECOMBINANTADENOVIRUSEXPRESSINGBLOODGROUPBMIMICPOLYPEPTIDES／FASONMOUSE4T1BREASTCANCER課題來(lái)源導(dǎo)師指定專業(yè)名學(xué)位申請(qǐng)指導(dǎo)教稱腫瘤學(xué)人姜兆靜師張積仁教授答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員陳尊器教授夏建川教授張為民教授黃宗海教授汪森明教授論文評(píng)閱人葛曰萍教授曹漫明副教授答辯秘書丁為民副教授2012年5月25日摘要抑制狀態(tài)是當(dāng)前腫瘤免疫治療的難題與突破點(diǎn)。研究目的應(yīng)用健康成人B型血全血腹腔注射免疫BALB／C小鼠使其體內(nèi)產(chǎn)生抗血型抗原B抗體；構(gòu)建BALB／C小鼠4T1乳腺痛荷瘤模型；在BALB／C小鼠荷瘤模型中瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽／FAS重組腺病毒，測(cè)定其在腫瘤組織中的表達(dá)情況，觀察其對(duì)人紅細(xì)胞懸液免疫后的小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)生存期的影響；測(cè)定瘤內(nèi)注射重組病毒后小鼠腫瘤微環(huán)境淋巴細(xì)胞、TNFA、IFN吖、IL2、微血管密度等免疫功能指標(biāo)，判定其對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)作用。實(shí)驗(yàn)方法1將健康成人全血稀釋成不同濃度紅細(xì)胞懸液，腹腔注射免疫BALB／C小鼠，每次02ML，2次／周，免疫后3天、7天、14天、21天、28天，分別測(cè)定小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗血型抗原B抗體效價(jià)，擇優(yōu)選擇最適宜的紅細(xì)胞懸液免疫濃度，分析抗體產(chǎn)生的趨勢(shì)，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備；2無(wú)菌環(huán)境下培養(yǎng)4TI孚L腺癌細(xì)胞，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備細(xì)胞懸液濃度為106／M1，小鼠乳腺脂肪墊區(qū)皮下注射上述濃度4T1乳腺癌細(xì)胞02ML。7天左右，腫瘤長(zhǎng)至LCMT左右大小，選取腫瘤無(wú)出血壞死的小鼠進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；3選取腫瘤大小相近、腫瘤無(wú)出血壞死的18只荷瘤小鼠，隨機(jī)分3組，分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒ADPL／FAS效價(jià)為7X1010PFU／ML、空腺病毒效價(jià)為221X1011PFU／ML、09％NACL01ML，連續(xù)注射3天。注射后第10天處死三組小鼠，取出腫瘤組織，應(yīng)用WESTERNBLOT方法測(cè)定B／FAS在腫瘤組織中的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀檢查腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞的變化、ELISA法測(cè)定TNFA、IFN吖、IL2含量、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34表達(dá)，并判定其對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)作用；436只荷瘤小鼠，分三組，每組12只，每組隨機(jī)取5只小鼠應(yīng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量三組小鼠腫瘤長(zhǎng)徑A和垂直寬徑B，比較注射前、注射后3天、7天、14天三組

簡(jiǎn)介：山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文不同全麻方式對(duì)老年患者消化道腫瘤手術(shù)后早期認(rèn)知功能的影響摘要目的比較不同全麻方式對(duì)老年患者消化道腫瘤手術(shù)后早期認(rèn)知功能的影響，以便于臨床工作，為老年消化道腫瘤患者選擇更安全麻醉方法。方法選擇90例擇期消化道腫瘤的病人ASA24分患者。病例排除標(biāo)準(zhǔn)術(shù)前有神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病史，服用相應(yīng)藥物者，腎功能損害及活動(dòng)性肝病者不參加本研究。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將患者隨機(jī)分為3組N30異丙酚全憑靜脈組P組；七氟醚與異丙酚靜吸復(fù)合組SP組；七氟醚吸入麻醉組S組；同期住院非手術(shù)患者30例作為對(duì)照組C組。所有患者未用術(shù)前藥，三組患者采用相同麻醉誘導(dǎo)方式，芬太尼46UEJKG，異丙酚1～2MG／蠔、羅庫(kù)溴銨06MG／KG依次緩慢靜注；不同麻醉維持方式，P組靜脈泵注異丙酚3～6MGKGDH‘1；SP組術(shù)中吸入七氟醚L％異丙酚3～6MGK茸1H。；S組術(shù)中吸入七氟醚1“3％。記錄各組患者的年齡、性別、身高、體重、受教育年限、并發(fā)癥、麻醉時(shí)間、手術(shù)類型、液體總?cè)肓康纫话闱闆r，分別于術(shù)前LD、出麻醉恢復(fù)室時(shí)、術(shù)后1、3和7D時(shí)，采用MMSEMINIMENTALSTATEEXAMINATION，MMSE量表進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)分，總分為30分，下降2分以上為認(rèn)知功能下降。認(rèn)知功能障礙POSTOPERATIVECOGNITIVEDYSFUNCTION，POCD判定，采用Z計(jì)分法，Z△X一△XC／SD△XC，Z計(jì)分≥196，認(rèn)為患者出現(xiàn)POCD。三組患者分別于術(shù)前1D與術(shù)后LD抽取靜脈血5ML，用酶聯(lián)免疫吸附ELISA法測(cè)定IL一1B、IL一6，操作按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果與C組比較，P組、SP組、S組于出麻醉恢復(fù)室時(shí)、術(shù)后LD時(shí)MMSE評(píng)分降低J|DO05。IL6、IL113術(shù)后1D較術(shù)前1D明顯增高PO05，與C組比較，P組、SP組、S組術(shù)后LD時(shí)IL一6、IL113明顯增高P005，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論老年患者在不同全麻方式下行消化道腫瘤手術(shù)后，出麻醉恢復(fù)室時(shí)、術(shù)后1天時(shí)認(rèn)知功能均下降，術(shù)后3天到7天基本恢復(fù)。三種全麻方式之間認(rèn)知功能障礙發(fā)生率無(wú)明顯差異，為臨床老年麻醉提供多種選擇。消化道腫瘤手術(shù)刺激強(qiáng)，IL6、IL1B升高可能與老年患者全麻下行消化道腫瘤手術(shù)后發(fā)生早期認(rèn)知功能障礙有關(guān)。關(guān)鍵詞全身麻醉；認(rèn)知功能障礙；老年；七氟醚；異丙酚1疵RENCE鋤。NGTHET11REEGROUPS；ALTLLOU曲T1ERE嘲SLIGHTLYDECREASEDIN3A11D7DAYS硪EF篡鰳ONJ哪D謝MTHEPREOPERATIVE，THEDIFFERENCEWASNOTSTATISTICALLYSI緲I(yè)FIC觚TPN05IL61L。1BLD砬ER、懈SIGNIFICANTLYHIGHERPO05廿LAILBEFORESURG≥二，I基WASNOS銣STJCALLYS19NIFICANTDIFFERENCESBETWEENGROUPS一UONCIIISIONS2‰妣SIAINELDERLYPATIENTSAFTERGASTROINTESTINALC齟CERSWGEUWHENLEAVINGR，EC，OVERYMOM，COGNITIVEFUNCTI。NATP。ST。PERATIVEDAY1DECLINED，A11I意砌LY剛弩DAYS觚E啪DAY跚ER№懈NODI‰CEINTHEANESTHESIA鋤ONG孟斫。衄KNDSOFC0嘶TIVEDYS觚CTION，WHICHPROVIDEDA唰ETY。FOPTI。NSFORC1孟SE蘭ANES齜警EXCESSIVEGAS拍INTESTINALNLIILORSS哪ICALSTILLLULATI。NA11DINN鋤MAT0珂。Y‘Ⅲ1圯SMAYNAVEANIMPACTONPOSTOPERATIVECOGNITIVEFUNCTIONW?！縔ORDSGENEMLA11ES也ESIA；POSTOPERA【TIVECOGNITIVEDYS脅CTI。N；ELDERLY；SEVONURANER1NDNTNI’一’

簡(jiǎn)介：急性呼吸道感染是導(dǎo)致人類特別是兒童致病和死亡的重要病因。病毒在呼吸道感染中扮演重要角色近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展不斷有新的病毒發(fā)現(xiàn)尤其是SARS和甲型H1N1流感病毒的出現(xiàn)進(jìn)一步提示加強(qiáng)新發(fā)病毒性傳染病研究的重要性。人偏肺病毒HMPV是2001年從下呼吸道感染兒童的呼吸道樣本中分離出來(lái)的一種新的病毒。目前將HMPV歸為副粘病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬。HMPV可感染各年齡人群癥狀重者多發(fā)于嬰幼兒老年人免疫抑制人群可導(dǎo)致上呼吸道和下呼吸道疾病。HMPV的感染存在地區(qū)和時(shí)間差異。目前HMPV在我國(guó)的流行率尚不清楚尤其是基于全基因組測(cè)序的分子特征研究尚少。此外缺乏快速有效的診斷HMPV感染的技術(shù)。為此本研究對(duì)北京地區(qū)HMPV毒株的基因特征和及近年全人群中的血清流行率進(jìn)行了研究并首次對(duì)HMPVF蛋白的線性表位進(jìn)行了篩選為闡明我國(guó)HMPV的流行特征和開(kāi)發(fā)特異性免疫診斷技術(shù)提供基礎(chǔ)。一、北京地區(qū)HMPV全基因組序列測(cè)定與分析利用RTPCR方法對(duì)2007年3月2009年4月期間收集的1542份兒童咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)HMPV檢出率為28％。隨機(jī)選取4份HMPV陽(yáng)性樣本采用隨機(jī)PCR方法擴(kuò)增后對(duì)其進(jìn)行了鳥(niǎo)槍法測(cè)序獲得了全基因組序列。序列分析和進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示四株均屬于A2基因型與國(guó)外代表株屬于不同進(jìn)化分支。4株HMPVF序列與A型A1A2亞型HMPVF序列同源性較高核苷酸序列同源性分別為973998和92193％而氨基酸序列同源性分別為952100％和944985％；與B型B1B2HMPVF蛋白序列同源性較低；4株HMPV實(shí)驗(yàn)株G蛋白高變區(qū)編碼核苷酸序列與DQ843659的相應(yīng)區(qū)域有相對(duì)較高保守性而與其他3株亞型代表株相比序列保守性較差。二、北京地區(qū)正常人群HMPV感染血清流行率研究利用大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)HMPVN蛋白進(jìn)行了表達(dá)經(jīng)過(guò)金屬螯合層析純化其純度達(dá)到90％以上。利用該抗原建立了ELISA方法對(duì)不同年齡組人群血清中的抗HMPVIGG抗體流行率進(jìn)行了研究。對(duì)1157份正常人群血清的篩查表明HMPV在人群中感染普遍≤6個(gè)月人群中抗體陽(yáng)性率為6667％以上6月1歲年齡組略有降低586％12歲為7347％隨著年齡的增長(zhǎng)抗體陽(yáng)性率逐漸升高至20歲之后抗體陽(yáng)性率達(dá)到了100％。相比而言人呼吸道合胞病毒RSV血清抗體IGG抗體水平在≤6月時(shí)抗體陽(yáng)性率為7140％6個(gè)月1歲抗體陽(yáng)性率為8448％12歲為858％抗體水平隨著年齡增高。到20歲以后抗體水平達(dá)到100％。這些數(shù)據(jù)提示HMPV在新生兒和嬰兒期的感染率可能低于RSV。三、HMPVF蛋白B細(xì)胞表位分析將HMPV和RSV的F、N蛋白基因分別插入重組腺病毒載體獲得了表達(dá)兩種蛋白的4種重組腺病毒。分別將4種腺病毒以滴鼻形式免疫小鼠制備抗HMPV和RSV的人偏肺病毒和人呼吸道合胞病毒的N蛋白以及F蛋白的抗血清。利用獲得的小鼠血清分別與HMPV和RSV的F和N蛋白反應(yīng)可見(jiàn)HMPV和RSV之間存在交叉免疫反應(yīng)。利用獲得的小鼠血清和HMPVIGG陽(yáng)性人血清利用55條合成肽通過(guò)PEPSCAN分析技術(shù)對(duì)HMPVF蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果顯示33條多肽可與人血清反應(yīng)其中12條多肽可與小鼠抗RSVF蛋白血清反應(yīng)其中10條與人血清篩選結(jié)果重疊。說(shuō)明二者存在交叉性表位。綜上所述本研究通過(guò)了解人偏肺病毒北京株的基因組特征和北京地區(qū)正常人群中感染情況以及B細(xì)胞表位的初步篩選為評(píng)估HMPV疾病負(fù)擔(dān)和其變異趨勢(shì)提出防控策略以及建立特異性免疫診斷技術(shù)和血清流行病學(xué)研究方法提供了必要的理論依據(jù)。

簡(jiǎn)介：橋本氏甲狀腺炎（HASHIMOTO’STHYROIDITISHT）又稱慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，于1912年由日本學(xué)者橋本策博士首先報(bào)道而得名，是人類最常見(jiàn)的器官特異性自身免疫性疾病。臨床上，HT常見(jiàn)于女性，患者血清常有多種自身抗體。HT的主要病理學(xué)表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及次級(jí)淋巴濾泡形成，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞常嗜酸性變（HüRTHLE細(xì)胞形成）并進(jìn)行性破壞。HT不僅會(huì)引起甲狀腺功能持續(xù)低下，而且與甲狀腺癌及惡性淋巴瘤的發(fā)生相關(guān)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量甚至生命。該病雖經(jīng)百年研究，其病因及發(fā)病機(jī)理仍未闡明。大量研究表明，遺傳以及環(huán)境因素與HT的病因密切相關(guān)，其中環(huán)境因素中的病毒感染越來(lái)越受到關(guān)注。但其發(fā)病機(jī)制目前并不清楚。人細(xì)小病毒B19（PARVOVIRUSB19B19）是一種無(wú)包膜單鏈DNA病毒，屬于自主性細(xì)小病毒，與非自主性細(xì)小病毒的區(qū)別即在宿主細(xì)胞中的復(fù)制并不需要其他病毒的參與。是小病毒屬中唯一對(duì)人類致病的病毒。B19感染與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)，其中，與HT的關(guān)系是該領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)之一。實(shí)驗(yàn)室以及美國(guó)、德國(guó)、日本多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的獨(dú)立研究表明，B19感染與HT的發(fā)病有關(guān)，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。二十世紀(jì)末，HOFFMANN和BEUTLER先后在果蠅和小鼠細(xì)胞中證實(shí)了TOLL樣受體（TOLLLIKERECEPTSTLRS）的存在。作為一大類細(xì)胞膜受體分子，TLRS能夠識(shí)別病毒等病原微生物，啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)并產(chǎn)生大量的促炎癥因子和共刺激分子，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的發(fā)生。由于這兩位科學(xué)家在先天免疫激活方面的突出貢獻(xiàn)，他們同時(shí)獲得了2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。TLR3作為TLR家族的重要成員之一，主要表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別病毒DSRNA，激活NFΚBIRF3以及AP1參與抗病毒反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3在HT甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中有表達(dá)，間接提示HT發(fā)生與某種感染有關(guān)。鑒于以上兩方面的研究，推測(cè)B19感染很可能激活了TLR3的表達(dá)。在HT報(bào)道百年之際，我們使用HT連續(xù)切片用免疫組織化學(xué)方法及免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記方法，研究了B19和TLR3在HT中的關(guān)系，對(duì)揭示B19感染與HT的發(fā)病機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【目的】闡明橋本氏甲狀腺炎病變甲狀腺組織中B19感染與TLR3間的關(guān)系，為HT的病毒病因?qū)W提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【方法】1用免疫組織化學(xué)SP法分別在HT標(biāo)本中檢測(cè)B19及TLR3的表達(dá)情況，利用IMAGEPROPLUS60軟件得到陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性率。2用免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法分析B19及TLR3在HT病變甲狀腺組織中的共表達(dá)（或共定位）情況。3采用SPEARMAN等級(jí)相關(guān)分析B19和TLR3在HT中的相關(guān)性，應(yīng)用FISHER精確概率法分析B19和TLR3在HT和正常甲狀腺組織中表達(dá)的差異。【結(jié)果】1B19和TLR3主要表達(dá)在HT病變甲狀腺組織中近淋巴濾泡的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)。33例HT病例中，29例B19陽(yáng)性，4例陰性；33例HT病變甲狀腺組織均表達(dá)TLR3。而在5例正常甲狀腺組織中兩者均為陰性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，TLR3和B19在HT（3333100％2933，88％）和正常甲狀腺組織中的表達(dá)具有顯著差異TLR3（P＜0001），B19（P＜0001）。2對(duì)33例HT標(biāo)本TLR3和B19陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性率并進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在HT中B19和TLR3表達(dá)呈顯著正相關(guān)（R0565P0001）。3免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色進(jìn)一步證實(shí)，B19與TLR3在HT甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中存在共表達(dá)?！窘Y(jié)論】發(fā)現(xiàn)橋本氏甲狀腺炎病變甲狀腺組織中TLR3表達(dá)與B19感染密切相關(guān)，提示TLR3表達(dá)很可能是B19感染誘導(dǎo)所致，表明兩者在HT的病毒病因?qū)W及發(fā)病機(jī)理中起重要作用。

簡(jiǎn)介：研究背景和目的目前常規(guī)檢測(cè)丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，HCV的方法主要包括核心抗原檢測(cè)、抗體檢測(cè)以及核酸檢測(cè)。多年以來(lái)，很多研究試圖建立血液中各種HCV抗原抗體以及核酸的檢測(cè)方法，但由于人體血液中HCV抗原抗體及核酸含量過(guò)低，用這些常規(guī)方法有時(shí)會(huì)無(wú)法檢測(cè)出HCV。HCV核心抗原檢測(cè)方法主要是用雙抗體夾心法檢測(cè)人體血清中的丙型肝炎核心抗原，該方法的基本步驟是用基因工程制備核心抗原進(jìn)行小鼠免疫后獲得純抗HCV核心抗原的單抗作為固相包被物，配合使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的2抗，與血清中的HCV核心抗原反應(yīng)，顯色后進(jìn)行定性或定量測(cè)定。該方法檢測(cè)具有延后性，而且靈敏度不高。另外一種檢測(cè)HCV的方法是將HCV病毒經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，再通過(guò)PCR將CDNA擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。但是由于血液中的RNA濃度低，有時(shí)并不能檢測(cè)到HCV的RNA，所以傳統(tǒng)的方法不能滿足丙肝病人的血清或者分泌物中極低濃度的RNA檢測(cè)。近年來(lái)，表面等離子共振SURFACEPLASMONRESONANCE，SPR已逐步成為研究和識(shí)別生物活性材料親和力作用的主要方法之一。SPR傳感器已逐步應(yīng)用到分析抗原抗體反應(yīng)、觀察DNA的雜交、診斷細(xì)菌和病毒引起的疾病和觀察血液凝固等。SPR傳感器之所以能夠?qū)⒕哂邢嗨苹瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的混合物區(qū)分開(kāi)，是因?yàn)镾PR能夠識(shí)別這些分析物，并且這些分析物能夠和固定在SPR傳感器表面上的生物活性物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)。SPR傳感器還可以免標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析物和活性物質(zhì)之間發(fā)生的反應(yīng)。SPR傳感器不僅可以監(jiān)測(cè)固定在材料上的分析物，還可以分析經(jīng)過(guò)解離新形成的混合物，在很多情況下，SPR可以用同一個(gè)芯片，進(jìn)行同時(shí)測(cè)量。因此，目前SPR是觀察配體和受體之間、抗原和抗體之間相互作用最有前景的一個(gè)方法，并且逐步應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)當(dāng)中。SPR在不斷擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域時(shí)，其檢測(cè)方法的靈敏度也需要不斷得到提高。因?yàn)镾PR方法對(duì)待測(cè)物濃度的測(cè)定主要與物質(zhì)的分子量有關(guān)，對(duì)于分子量大于1000的物質(zhì)，其可測(cè)定濃度范圍約為NMPM，而對(duì)于分子量小于1000的物質(zhì)，其可測(cè)定濃度范圍為ΜMNM。因此不斷探索提高靈敏度的研究方法正成為SPR研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。DNA芯片被大量用于快速、平行檢測(cè)多種DNA或RNA序列。隨著越來(lái)越多的斑點(diǎn)技術(shù)的擴(kuò)展，現(xiàn)在使用噴墨打印或光刻生產(chǎn)的DNA芯片，可以在一個(gè)小面積的固體支持物上點(diǎn)上15000種寡核苷酸鏈，因此目前很多研究已將DNA芯片應(yīng)用到MRNA定性定量檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性SINGLENUCLEOTIDEPOLYMPHISMS，SNPS的檢測(cè)。隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展使得單個(gè)DNA芯片探測(cè)整個(gè)基因組成為可能，但對(duì)低濃度的DNA靶序列檢測(cè)存在靈敏度不高的問(wèn)題依然是當(dāng)前芯片的主要缺點(diǎn)。而液相預(yù)擴(kuò)增方法可克服這一缺點(diǎn)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)POLYMERASECHAINREACTION，PCR技術(shù)，可用來(lái)擴(kuò)增芯片分析的目標(biāo)DNA。PCR技術(shù)由于其高靈敏度而被認(rèn)為是DNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，PCR技術(shù)因?yàn)樾枰嘿F的儀器、精確的溫度控制和對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離，況且不能原位擴(kuò)增，使它在芯片上的運(yùn)用受到極大地限制。因而迫切需要一種高靈敏度、高通量和高速度非PCR的簡(jiǎn)單的檢測(cè)分析方法。滾環(huán)擴(kuò)增ROLLINGCIRCLEAMPLIFICATION，RCA在體外使用DNA聚合酶和環(huán)狀DNA模板進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增，其基本原理是環(huán)狀模板與靶核酸雜交后在連接酶的作用下成環(huán)成環(huán)后的環(huán)狀模板在引物的作用下擴(kuò)增沿著環(huán)狀模板擴(kuò)增一個(gè)循環(huán)后，聚合酶合成再次到達(dá)了引物聚合酶結(jié)合位點(diǎn)取代新合成的DNA鏈繼續(xù)合成多個(gè)環(huán)狀模板長(zhǎng)度的擴(kuò)增鏈，由此形成一條由重復(fù)的環(huán)狀模板序列組成的長(zhǎng)鏈DNA分子。并且由于環(huán)狀模板的擴(kuò)增效率比線性模板要高很多，因此單引物RCA已被廣泛用于基因分型和掛鎖探針進(jìn)行突變分析。RCA是一種對(duì)芯片信號(hào)放大特別有效的方法，在芯片上就能夠識(shí)別、擴(kuò)增、檢測(cè)目標(biāo)分子。與其它擴(kuò)增方法相區(qū)別的是，RCA擴(kuò)增生成的擴(kuò)增產(chǎn)物仍然和固定在芯片上的DNA引物連接。由于這種獨(dú)特的屬性，使RCA能在固相的原位產(chǎn)生微陣列信號(hào)，并且與其它反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行也沒(méi)有任何互相干擾?；诩{米金的光學(xué)檢測(cè)可以提供一個(gè)可視化的可見(jiàn)光范圍。由于這種光學(xué)檢測(cè)是依靠基礎(chǔ)的光學(xué)現(xiàn)象，所以檢測(cè)過(guò)程比熒光技術(shù)要簡(jiǎn)單得多，樣品的穩(wěn)定性也被加強(qiáng)了。相比于熒光染料具有敏感性和漂白問(wèn)題，納米金技術(shù)即使是在高光強(qiáng)度下也可進(jìn)行檢測(cè)，并且還能降低理化環(huán)境對(duì)信號(hào)的影響。納米金技術(shù)可以擴(kuò)增SPR的檢測(cè)信號(hào)，相比非納米金輔助的雜交反應(yīng)大大提高了靈敏度。表面質(zhì)量高和介電常數(shù)高的納米金粒子和金膜之間的電磁耦合大大提高了反射轉(zhuǎn)變。納米金粒子標(biāo)簽具有高信號(hào)噪聲比使得點(diǎn)大小接近亞微米級(jí)，而熒光芯片僅有微米級(jí)。納米金法可以利用光學(xué)方法讀出結(jié)果而不需要熒光設(shè)備，并且納米金修飾的寡核苷酸探針可以再生方法再利用，以節(jié)約成本。本文將生物傳感技術(shù)、原位擴(kuò)增技術(shù)以及納米技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用SPR儀檢測(cè)納米金輔助的RCA反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)快速、非標(biāo)記、靈敏、實(shí)時(shí)檢測(cè)丙型肝炎病毒。研究方法1丙型肝炎病毒RCA檢測(cè)方法的建立11RCA引物設(shè)計(jì)從GENEBANK中獲得丙型肝炎病毒XTAIL基因序列，根據(jù)RCA引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)RCA檢測(cè)HCV所需要的環(huán)狀模板、延伸引物以及擴(kuò)增引物。12丙型肝炎病毒核酸RCA檢測(cè)方法反應(yīng)條件摸索以及反應(yīng)體系的建立根據(jù)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，將連接酶分為T4DNA連接酶、PFUDNA連接酶和BSTDNA連接酶三組。將多聚酶分為BSTDNA多聚酶和PHI29DNA連接酶兩組，共六組進(jìn)行試驗(yàn)。依據(jù)TM值，RCA反應(yīng)原理以及酶的活性溫度，來(lái)測(cè)試反應(yīng)溫度。13丙型肝炎病毒核酸RCA檢測(cè)方法特異性測(cè)試選取流感病毒核酸作為陰性對(duì)照，選取實(shí)驗(yàn)室制備的丙型肝炎病毒核酸純化標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水作為空白對(duì)照，以RCA方法評(píng)價(jià)丙型肝炎病毒的特異性。14丙型肝炎病毒RCA檢測(cè)方法最低檢測(cè)濃度測(cè)試將經(jīng)過(guò)定量的HCVCDNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，運(yùn)用RCA方法確定其檢測(cè)限值。2REALTIMERTPCR法檢測(cè)丙型肝炎病毒選取HCV最保守區(qū)域XTAIL基因區(qū)域?yàn)槟康男蛄?，設(shè)計(jì)REALTIMEPCR引物。運(yùn)用REALTIMEPCR法檢測(cè)HCV，通過(guò)檢測(cè)梯度濃度確定其檢測(cè)限，與RCA的檢測(cè)限進(jìn)行比較。3滾環(huán)擴(kuò)增芯片檢測(cè)HCVCDNA將RCA的探針進(jìn)行氨基修飾，與醛基芯片共價(jià)結(jié)合后，通入檢測(cè)體系進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)，以檢測(cè)HCVDNA。4傳統(tǒng)芯片檢測(cè)HCVCDNA將經(jīng)過(guò)定量的HCVCDNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，用傳統(tǒng)芯片檢測(cè)，并將其檢測(cè)限值與RCA芯片法進(jìn)行比較。5SPR技術(shù)結(jié)合RCA法檢測(cè)HCV根據(jù)丙型肝炎XTAIL區(qū)域的特異序列，設(shè)計(jì)并合成RCA法的探針和引物，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。將模板濃度10倍梯度稀釋，評(píng)價(jià)方法的檢測(cè)限。在普通金膜芯片的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)表面化學(xué)處理，形成高特異性核酸芯片，用抗蛋白實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芯片抗蛋白能力。使用SPR儀對(duì)金膜芯片上滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)以及信號(hào)放大反應(yīng)等。6普通SPR技術(shù)對(duì)HCV的檢測(cè)1普通SPR金膜芯片制備將裸金膜芯片孵育于12巰基十二烷酸中過(guò)夜進(jìn)行自組裝羧基化，再用EDCNHC1乙基33二甲氨基丙基碳二亞胺EDCN羥基丁二酰亞胺NHYDROXYSUCEINIE，NHS進(jìn)行活化后點(diǎn)樣探針。2用1％的BSA對(duì)未結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉。3評(píng)價(jià)SPR檢測(cè)HCV的靈敏度、特異性。7運(yùn)用RCA、，REALTIMEPCR、GENOCHIP、，RCAGENOCHIP、SPR、SPR結(jié)合RCA等技術(shù)對(duì)臨床樣品HCV的檢測(cè)。采用1～6方法中描述的丙型肝炎病毒RCA、REALTIMERTPCR、滾環(huán)擴(kuò)增芯片法、傳統(tǒng)芯片方法、SPR技術(shù)結(jié)合RCA法、普通SPR法檢測(cè)臨床血清標(biāo)本中的丙型肝炎病毒。對(duì)上述檢測(cè)方法的靈敏度，特異性以及一些其它指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果1丙型肝炎病毒RCA方法的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)以及評(píng)價(jià)臨床樣品的檢測(cè)RCA方法對(duì)HCV的最低檢測(cè)濃度為10PM，REALTIMERTPCR檢測(cè)的的最低濃度為01NM。對(duì)63份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中丙型肝炎病人血清標(biāo)本30份，非丙型肝炎血清標(biāo)本33份。在雙盲的情況下，RCA法的靈敏度為800％2430，檢測(cè)30份丙型肝炎血清標(biāo)本，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出16份。RCA檢測(cè)33份HCV陰性血清特異度為879％2933，實(shí)時(shí)熒光定量PCR為909％3033。2建立滾環(huán)擴(kuò)增芯片檢測(cè)HCV的方法以及對(duì)臨床樣品檢測(cè)的評(píng)價(jià)RCA芯片法檢測(cè)HCV的最低檢測(cè)濃度為01ΜM。而應(yīng)用傳統(tǒng)雜交方法檢測(cè)HCVCDNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為10ΜM。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室條件下檢測(cè)HCVEDNA，RCA比傳統(tǒng)雜交法更敏感。用RCA芯片對(duì)一共179份臨床血清進(jìn)行了檢測(cè)，其中包括丙型肝炎病人血清樣品102份，甲肝及乙肝病人的血清樣品77份。在雙盲的情況下，RCA的敏感性為873％89102，特異性為857％6677，一致性為866％155179，結(jié)果顯示RCA芯片法檢測(cè)HCV的靈敏度和特異度均較好。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89％89100，陰性預(yù)測(cè)值為835％6679。檢測(cè)102份丙型肝炎血清標(biāo)本，RCA芯片檢測(cè)出89份，普通芯片只檢出27份。檢測(cè)77份陰性樣品，RCA檢測(cè)為陰性的66份，普通芯片為69份。RCA芯片高靈敏度、快速，因此在丙型肝炎病毒的檢測(cè)中比現(xiàn)有的普通芯片有更大的優(yōu)越性和實(shí)用性。3SPR技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中HCV滾環(huán)擴(kuò)增法在1H內(nèi)完成HCV標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，SPR結(jié)合RCA方法對(duì)HCV的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)濃度為1PMOLL，REALTIMEPCR的最低檢測(cè)濃度為100PMOLL。在檢測(cè)相同的HCV濃度時(shí)，RCA的SPR信號(hào)明顯高于傳統(tǒng)的雜交信號(hào)，RCA反應(yīng)經(jīng)過(guò)納米金信號(hào)放大，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程更加清晰，反應(yīng)信號(hào)也得到擴(kuò)大。對(duì)于臨床樣品的檢測(cè)，RCA結(jié)合SPR技術(shù)的靈敏度為90％2730，特異性為841％2833。結(jié)論1本研究建立的SPR結(jié)合RCA方法，在1H內(nèi)完成HCV的檢測(cè)，比熒光定量PCR有更低的檢測(cè)限。2運(yùn)用RCA法檢測(cè)同樣濃度的HCV時(shí)，RCA的SPR信號(hào)明顯高于傳統(tǒng)的雜交的SPR信號(hào)RCA，經(jīng)過(guò)納米金的信號(hào)放大，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程流程更加清晰，反應(yīng)信號(hào)得到進(jìn)一步擴(kuò)大。3對(duì)于臨床血清樣品，研究結(jié)果顯示RCA法的靈敏度比REALTIMEPCR要高，特異度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。4由于SPR結(jié)合RCA檢測(cè)HCV快速、不需要特殊設(shè)備，因此在丙型肝炎病毒的檢測(cè)中比現(xiàn)有的REALTIMEPCR方法有更大的優(yōu)越性和實(shí)用性。5本文實(shí)現(xiàn)了SPR檢測(cè)納米金輔助的RCA反應(yīng)，將來(lái)可能對(duì)超靈敏的核酸進(jìn)行檢測(cè)，這將為一些極低濃度核酸樣品的檢測(cè)提供可能。SPR技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增法將生物傳感技術(shù)及原位擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了快速、非標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)丙型肝炎病毒，可作為丙型肝炎病毒篩查方法。

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簡(jiǎn)介：乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV感染嚴(yán)重影響人類的健康和生命安全目前對(duì)慢性HBV感染者和攜帶者無(wú)特效治療方法。HBV基因組較小易發(fā)生突變限制了靶向病毒的抗病毒藥物研究。為了研究和開(kāi)發(fā)新型抗HBV藥物我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型雙功能SIRNA5PPPSIRNA3PSIRNA核酸藥物一方面通過(guò)刺激宿主細(xì)胞模式識(shí)別受體誘導(dǎo)宿主抗病毒Ⅰ型干擾素的表達(dá)同時(shí)通過(guò)RNAI作用特異性沉默HBV基因表達(dá)從而抑制病毒復(fù)制。3PSIRNA結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RNAINDUCEDSILENCINGCOMPLEXRISC由RISC介導(dǎo)切割靶MRNA分子中與3PSIRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域從而達(dá)到沉默特異性基因表達(dá)作用同時(shí)3PSIRNA可以活化維甲酸誘導(dǎo)基因ⅠRETIONICACIDINDUCIBLEGENELRIGI使RIGI與位于線粒體外膜的銜接蛋白干擾素啟動(dòng)子刺激因子1IFNΒPROMOTERSTIMULAT1IPS1CARDIFCARDADAPTINDUCINGIFNΒMAVSMITOCHONDRIALANTIVIRALSIGNALINGVISAVIRUSINDUCEDSIGNALINGADAPTER相互作用下傳信號(hào)激活核轉(zhuǎn)錄因子ΚBNUCLEARFACTΚBNFΚB或干擾素調(diào)節(jié)因子INTERFERONREGULATYFACT3IRF3等誘導(dǎo)Ⅰ型IFN和促炎因子的表達(dá)和分泌從而實(shí)現(xiàn)抑制HBV的目的。本研究首先通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄生成3PSIRNA。通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在100NM200NM時(shí)3PSIRNA對(duì)HEPG2215細(xì)胞無(wú)顯著毒性但是在500NM時(shí)3PSIRNA對(duì)HEPG2215細(xì)胞具有一定毒性。研究發(fā)現(xiàn)將IFNΒ熒光素酶報(bào)告基因與RIGI共同轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入海腎蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因作為內(nèi)參轉(zhuǎn)染24小時(shí)后將3PSIRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞16小時(shí)后檢測(cè)IFNΒ熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染RIGI時(shí)3PSIRNA只能微弱地誘導(dǎo)IFN表達(dá)但是共轉(zhuǎn)RIGI后3PSIRNA顯著地誘導(dǎo)IFN表達(dá)說(shuō)明在HEPG2215細(xì)胞中3PSIRNA具有RIGI依賴的激活宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。然而我們用CIAP去除3PSIRNA5末端的5PPP基團(tuán)后將其與IFNΒ熒光素酶報(bào)告基因和RIGI共同轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞后檢測(cè)IFNΒ熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)經(jīng)CIAP處理的3PSIRNA并未激活RIGI介導(dǎo)的IFN通路說(shuō)明3PSIRNA誘導(dǎo)IFN表達(dá)主要是依賴于其5末端的5PPP基團(tuán)。此外3PSIRNA對(duì)干擾素刺激調(diào)控元件ISRE也具有RIGI依賴的激活效應(yīng)在未共轉(zhuǎn)RIGI時(shí)3PSIRNA微弱地誘導(dǎo)ISRE表達(dá)然而共轉(zhuǎn)RIGI后3PSIRNA明顯地誘導(dǎo)ISRE表達(dá)。抗病毒活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)在HEPG2215細(xì)胞中與SIRNA抗HBV活性相比3PSIRNA表現(xiàn)出更明顯的抗病毒活性。3PSIRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后對(duì)HBSAG、HBEAG以及HBVDNA和HBVMRNA都有明顯的抑制效果。3PSIRNA對(duì)HBV具有持續(xù)的抑制效應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)染3PSIRNA后48小時(shí)、96小時(shí)、144小時(shí)3PSIRNA對(duì)HBSAG和HBEAG的抑制率分別是55％和418％、37％和243％、333％和148％當(dāng)共轉(zhuǎn)染RIGI和3PSIRNA時(shí)3PSIRNA對(duì)HBAG和HBEAG的抑制率分別是663％和53％、555％和497％、456％和265％。與只轉(zhuǎn)染3PSIRNA相比共轉(zhuǎn)染RIGI時(shí)3PSIRNA對(duì)HBV表現(xiàn)出更明顯的抑制活性。以不同劑量50NM、100NM、200NM3PSIRNA轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞發(fā)現(xiàn)3PSIRNA對(duì)HBV的抑制作用呈明顯劑量依賴性。綜上所述本研究成功設(shè)計(jì)了一種新型雙功能抗HBV核酸藥物3PSIRNA一方面具有能通過(guò)RNAI特異識(shí)別并切割HBVMRNA靶分子從而抑制HBV特性同時(shí)可以激活宿主細(xì)胞RIGI依賴的抗病毒天然免疫反應(yīng)從而高效阻止HBV復(fù)制。抗HBV雙功能3PSIRNA核酸藥物的發(fā)現(xiàn)為研究開(kāi)發(fā)新型抗HBV藥物研究具有重要應(yīng)用價(jià)值。

簡(jiǎn)介：重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文腺病毒介導(dǎo)的RNAI對(duì)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)NGR表達(dá)、軸突再生和神經(jīng)行為的影響姓名王敬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師秦新月20090501重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文毒純化試劑盒純化病毒，TCID50測(cè)定病毒滴度；2．應(yīng)用高、中、低三種滴度劑量的重組腺病毒和腺病毒保存液陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染大鼠缺血腦組織，采用組織病理學(xué)觀察局部炎癥反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，篩選出最佳的轉(zhuǎn)染滴度；3．采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血MIDDLECEREBRALARTERYOCCLUSION，MCAO／再灌注模型，42只大鼠隨機(jī)分為7組假手術(shù)組，腦缺血2H再灌注24H、2W組缺血再灌注組和重組腺病毒載體ADSHRNANGR干預(yù)24H、2W組腺病毒干預(yù)組，重組腺病毒載體AD．SHRNA．HK干預(yù)24H、2W組陰性對(duì)照組。采用RTPCR檢測(cè)缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬NGRMRNA水平，WESTERNBLOTTING檢測(cè)NGR蛋白表達(dá)；4．20只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組和腺病毒干預(yù)組，陰性對(duì)照組。腦缺血2H再灌注24H、9W后行增強(qiáng)CT測(cè)量腦梗死體積，術(shù)后每隔一周進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，生物素葡聚糖胺BDA神經(jīng)示蹤技術(shù)觀察皮質(zhì)脊髓束和皮質(zhì)紅核束。結(jié)果1．重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到明確的綠色熒光，擴(kuò)增并純化后AD．SHRNA．NGR的滴度為3．16X1010PFU／ML；AD．SHRNA．HK的滴度為2．84X1010PFU／ML。2．高、中、低劑量組大鼠腦組織均出現(xiàn)GFP陽(yáng)性表達(dá)，且高、中劑量組轉(zhuǎn)染效率明顯高于低劑量組，但高劑量組與中劑量組無(wú)明顯差異。HE染色顯示，僅高劑量組中大鼠腦組織有炎性浸潤(rùn)，余均未發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)。3．與假手術(shù)組相比，腦缺血2H再灌注24H、2W后，NGE．RNRNA和蛋白水平均明顯增高PO．01，腺病毒干預(yù)后NGRMRNA和蛋白表達(dá)氣

簡(jiǎn)介：同等學(xué)力申請(qǐng)博士學(xué)位博士學(xué)位論文學(xué)校代碼10023學(xué)號(hào)ZB2007021宮頸病變中P16INK4A蛋白與耶V病毒的關(guān)系及其與L1殼蛋白的聯(lián)合表達(dá)意義THERELATIONSHIPOFPL6INK4AWITHHPVANDTHEVALUEOFP16INK4AANDL1EXPRESSIONINCERVICALLESIONS所院姓名指導(dǎo)教師導(dǎo)師小組學(xué)科專業(yè)研究方向完成日期腫瘤醫(yī)院宋艷蘇勤張?jiān)兲K勤張?jiān)儣罴t鷹病理學(xué)婦科腫瘤病理2011年5月目錄目錄英文縮略語(yǔ)與中文解釋L中文摘要2ABSTM4前言6第一部分探討宮頸病變中P16INK4A蛋白的表達(dá)及其與HRFIPV的關(guān)系8材料與方法8研究對(duì)象8實(shí)驗(yàn)器材與方法81主要儀器與試劑811主要儀器812主要試N92方法1021組織染色1022病理診斷1123HC2一HPVDNA檢測(cè)1224統(tǒng)計(jì)學(xué)處理13結(jié)果131P16INK4A蛋白在子宮頸病變的表達(dá)132HRHPV在子宮頒病變的分布133P16INK4A蛋白表達(dá)與HRHPV的關(guān)系15討論16第二部分探討宮頸病變中P16INK4A蛋白與HPV亞型的關(guān)系及其與LL殼蛋白的聯(lián)合表達(dá)方式2L材料與方法21研究對(duì)象21實(shí)驗(yàn)器材與方法211主要儀器與試劑2111主要儀器2112主要試劑222方法2221石蠟切片2222組織染色及免疫組織化學(xué)染色2323HPV檢測(cè)DEIA法及分型實(shí)驗(yàn)LIPA法2524統(tǒng)計(jì)學(xué)處理3L結(jié)果311P16INK4A蛋白在宮頸病變中的表達(dá)312L1殼蛋白在宮頸病變中的表達(dá)313P16INK4A蛋白與L1殼蛋白的不同聯(lián)合表達(dá)方式334HPV亞型分析及其與P16INK4A蛋白、LL殼蛋白的關(guān)系3441HPV弧型在宮頸上皮內(nèi)病變的分布3442CIN2、CIN3和ICC患者多重感染的HPV型別3543P16INK4A蛋O／L1殼蛋白與HPV各亞型的關(guān)系35討論36舢3洲7刪6舢5Ⅲ8洲9川1刪Y

簡(jiǎn)介：軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院解放軍總醫(yī)院碩士學(xué)位論文老年男性腦白質(zhì)病變患者認(rèn)知功能特點(diǎn)及危險(xiǎn)因素的研究姓名朱文佳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師賈建軍20120517軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩_L學(xué)位論文重降低趨勢(shì)，其中①PVL中重度組MOCA總分與對(duì)照組、輕度組相比；輕、中重度組定向力得分與對(duì)照組相比；中重度組延遲回憶得分與對(duì)照組相比輕度組注意力得分與中重度組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．05。2DWML中重度組MOCA總分與命名得分與對(duì)照組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．05。結(jié)論老年男性患者腦白質(zhì)病變與認(rèn)知功能減退有關(guān)，腦室旁腦白質(zhì)病變對(duì)認(rèn)知功能的影響較深部腦白質(zhì)病變明顯。第三部分老年男性腦白質(zhì)病變患者認(rèn)知功能障礙危險(xiǎn)因素的分析目的探討老年男性WML患者認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素。方法1．選取住院期間的WML患者64例，引入MOCA量表進(jìn)行認(rèn)知心理學(xué)評(píng)估，收集臨床資料，完善實(shí)驗(yàn)室及顱腦MRI等檢查。2．將患者分成輕度認(rèn)知功能障礙組MCI組，31例和認(rèn)知功能正常組NC組，33例，行單因素分析和多因素LOGISTIC回歸分析。結(jié)果1．單因素分析兩組在年齡、教育年限、吸煙等3方面差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．05；2．以有無(wú)認(rèn)知功能障礙為因變量行逐步LOGISTIC回歸分析，得到教育年限P值0．003，OR值0．867、吸煙P值0．005，OR值5．151、腔隙性腦梗死P值O．037，OR值3．766與腦白質(zhì)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生有關(guān)。結(jié)論部隊(duì)老年男性高干腦白質(zhì)病變患者認(rèn)知功能障礙主要與教育年限、腔隙性腦梗死和吸煙有關(guān)。關(guān)鍵詞老年、腦白質(zhì)病變、認(rèn)知功能、危險(xiǎn)因素4

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)觀察AM251干預(yù)后2型糖尿病腦病大鼠海馬組織中Γ氨基丁酸GABA、SRC、N乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白NSF及谷氨酸受體NR2A亞基酪氨酸磷酸化表達(dá)的變化，探討AM251對(duì)2型糖尿病腦病大鼠認(rèn)知功能的影響及其作用機(jī)制。方法采用高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素STZ腹腔注射的方法，建立2型糖尿病大鼠模型。將成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病組DM組、AM251干預(yù)組AM組、并設(shè)立正常對(duì)照組NC組。給藥4周后，檢測(cè)空腹血糖FBG、糖化血紅蛋白A1CHBA1C、甘油三酯TG、總膽固醇TC、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL；行Y迷宮測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力，蘇木素伊紅HE染色觀察海馬神經(jīng)元的存活，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬中GABA、SRC的表達(dá)，WESTERNBLOTTIN法檢測(cè)NSF蛋白表達(dá)的變化，免疫沉淀、免疫印跡法檢測(cè)海馬中NR2A亞基酪氨酸磷酸化水平的變化。結(jié)果1與NC組比較，DM組FBG、HBA1C、TG、TC、LDL明顯升高，HDL明顯降低P005。2與NC組比較，DM組和AM組大鼠Y迷宮學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低P結(jié)論1長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，糖尿病大鼠認(rèn)知能力下降，可能的機(jī)制是谷氨酸通過(guò)作用于谷氨酸受體的NR2A亞基，通過(guò)上調(diào)其磷酸化的表達(dá)，產(chǎn)生興奮性毒性作用。2高血糖狀態(tài)下TG、TC、LDL升高，HDL降低；糖尿病腦病還可能通過(guò)下調(diào)GABA的表達(dá)，降低其突觸前、突觸后的抑制作用，使其對(duì)抗谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性的作用減弱，加重腦損傷。3AM251能改善2型糖尿病腦病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、減輕腦損傷。其機(jī)制可能是通過(guò)減輕脂毒性、抑制NSF的表達(dá)、下調(diào)SRC介導(dǎo)的谷氨酸受體NR2A亞基的磷酸化水平，上調(diào)GABA的水平實(shí)現(xiàn)的，且這種作用是獨(dú)立于降糖作用之外的。

簡(jiǎn)介：目的本研究通過(guò)構(gòu)建PEDF基因重組慢病毒載體，將其轉(zhuǎn)染至大鼠心肌以調(diào)節(jié)PEDF表達(dá)，探討PEDF對(duì)正常大鼠心肌血管生成中的作用。方法構(gòu)建大鼠過(guò)表達(dá)PEDF和PEDFSIRNA重組慢病毒；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為六組正常組A、過(guò)表達(dá)組B、干擾組C、載體對(duì)照組D、假手術(shù)組E、梗死組F；采用分點(diǎn)注射法轉(zhuǎn)染PEDF過(guò)表達(dá)載體和PEDFSIRNA表達(dá)載體至大鼠心臟左室心肌組織，通過(guò)調(diào)控干擾或過(guò)表達(dá)大鼠心肌局部PEDF表達(dá)，檢測(cè)PEDF轉(zhuǎn)染局部心肌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VULARENDOTHELIALCELLGROWTHFACT，VEGF、腫瘤壞死因子ΑTUMNECROSISFACTΑ，TNFΑ和低氧誘導(dǎo)因子1ΑHYPOXIAINDUCIBLEFACT1Α，HIF1Α蛋白表達(dá)的變化。通過(guò)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2VULARENDOTHELIALCELLGROWTHFACTRECEPT2，VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和ΑSMA陽(yáng)性血管數(shù)量，觀察PEDF對(duì)心肌血管生成的影響。結(jié)果1PEDF過(guò)表達(dá)和PEDFSIRNA質(zhì)粒鑒定PEDF過(guò)表達(dá)質(zhì)?？捎行н^(guò)表達(dá)PEDF蛋白；PEDFSIRNA質(zhì)粒可有效干擾PEDF蛋白表達(dá)，質(zhì)粒構(gòu)建成功。2病毒滴度檢測(cè)重組病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，REALTIMEPCR測(cè)定病毒滴度為200E9TUML。3動(dòng)物模型的建立和基因轉(zhuǎn)染大鼠心臟左室前壁注射各組試劑后觀察，心電圖示未心肌損傷性改變；梗死組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后，肉眼觀察缺血心肌局部顏色變紫，心電圖描記術(shù)后ST段弓背向上抬高。美藍(lán)注射實(shí)驗(yàn)證明試劑可浸潤(rùn)心肌全層，心肌注射方法可用于基因轉(zhuǎn)染。熒光顯微鏡下觀察，過(guò)表達(dá)組、干擾組及載體對(duì)照組可于轉(zhuǎn)染局部觀察到GFP綠色熒光，而其他各組無(wú)GFP表達(dá)。4VEGF、VEGFR2、TNFΑ和HIF1Α基因表達(dá)的檢測(cè)RTPCR和WESTERNBLOT結(jié)果顯示，與正常組比較，干擾組PEDF表達(dá)明顯下降，而過(guò)表達(dá)組PEDF上升P5轉(zhuǎn)染心肌局部炎癥細(xì)胞的檢測(cè)HE染色顯示，與正常組相比，干擾組轉(zhuǎn)染局部中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P6轉(zhuǎn)染心肌局部血管生成的檢測(cè)免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，干擾組VEGFR2新生血管陽(yáng)性血管顯著增加P005。結(jié)論1PEDFSIRNALENTIVIRUS和PEDFLENTIVIRUS構(gòu)建成功，可有效調(diào)控大鼠心肌PEDF蛋白表達(dá)。2在心肌組織中，PEDF通過(guò)調(diào)VEGF和VEGFR2表達(dá)，影響心肌血管生成，但對(duì)已存在血管無(wú)調(diào)節(jié)作用。3非缺氧條件下，PEDF對(duì)VEGF的調(diào)控并非HIF1Α介導(dǎo)。4抑制PEDF表達(dá)可誘發(fā)心肌炎癥反應(yīng)。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多FOXP3基因過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎免疫耐受作用的研究.pdf精彩內(nèi)容。