簡介：酵母中含有豐富的蔗糖酶EC32126,細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)，含有少量的糖。,,,,,,,,,,,外蔗糖酶,內(nèi)蔗糖酶,細(xì)胞膜的外側(cè)，占蔗糖酶活力的大部分，是含有50糖成分的糖蛋白。,由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。,實(shí)驗(yàn)一酵母蔗糖酶的提取與純化,本實(shí)驗(yàn)以酵母為原料，通過破碎細(xì)胞、加熱除雜蛋白、乙醇沉淀、離子交換柱層析等步驟，分離純化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝膠電泳對其純度進(jìn)行初步檢驗(yàn)。,,有機(jī)溶劑分級的原理有機(jī)溶劑分級是利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。其原理是1、有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)溶解度下降；2、有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。,結(jié)合力的大小取決于彼此之間相反電荷基團(tuán)的靜電引力,靜電引力大小與溶液的PH值有關(guān)，因PH值決定蛋白質(zhì)的解離程度。,陽離子交換劑樣品溶液PH＜PI時(shí)，酶帶正電荷；陰離子交換劑樣品溶液PH＞PI時(shí)，酶帶負(fù)電荷一般樣品溶液的PH與酶PI相差一個(gè)PH以上,樣品溶液的PH與酶PI相差越大的，帶電荷越多,通過逐漸增加洗脫液離子強(qiáng)度的梯度洗脫方式，可使結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)按照結(jié)合力由小到大的順序依次被洗出層析柱。,,,,SAMPLEAPPLICATIONANDWASH,ELUTION,EQUILIBRATION,REGENERATION,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,本實(shí)驗(yàn)中使用的DEAE52是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為二乙基氨乙基（DEAE）。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。,控制樣品溶液PH＞PI時(shí)，酶帶負(fù)電荷,離子交換柱層析的原理根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)在分離過程中，以離子交換劑作用為主導(dǎo)。在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)是1、開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對蛋白質(zhì)吸附容量大；2、纖維素上離子基團(tuán)數(shù)量不多且排列疏散，對蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離目的，不致引起蛋白質(zhì)變3、用其裝好的層析柱在較廣的PH和鹽濃度范圍內(nèi)都不會(huì)發(fā)生體積的改變，所以有利于蛋白質(zhì)層析。本實(shí)驗(yàn)中使用的DEAE52是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為二乙基氨乙基（DEAE）。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。,為了確定哪個(gè)峰是含目標(biāo)酶，要進(jìn)行酶活力的測定；用蔗糖做底物反應(yīng)一段時(shí)間后，檢測生成的葡萄糖的量；用尿糖試紙初步檢測；用DNS法精確檢測。,SUCRASE（蔗糖酶）,GLUCOSE＋FRUCTOSE,SUCROSE,SEMIQUANTITATIVEASSAYOFYEASTSUCRASEACTIVITYWITHUGLUTESTTAPESUCROSEGLUCOSEOXIDASE（葡萄糖氧化酶）GLUCONICACID＋H2O2（葡萄糖酸）H2OO2COLOUREDSUBSTANCE,SUCRASE（蔗糖酶）,GLUCOSE＋FRUCTOSE,HYDROGENPEROXIDASE（過氧化氫酶）,COLOURLESSSUBSTANCE（無色物質(zhì)）,,,UGLUTESTTAPE尿糖試紙,DNS法精確檢測,黃色的3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3氨基5硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又與待測液的酶活力大小成正比。,酶活定義在37℃，PH45，每分鐘催化蔗糖生成1ΜM葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。,DNS法測葡萄糖濃度,附圖葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,為了確定獲得的目標(biāo)酶純不純，要進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測；,二、實(shí)驗(yàn)步驟,1破碎細(xì)胞取5G干酵母，加5G石英砂，置于預(yù)先冷卻的研缽中，加30ML去離子水，研磨30MIN，在冰箱中冰凍約10MIN（研磨液面上剛出現(xiàn)冰結(jié)為宜），重復(fù)2次。將研磨液轉(zhuǎn)移至大離心管中，12000R/MIN離心15MIN，棄去沉淀。留05ML上清液為第一組分。,2加熱除雜蛋白將上清液轉(zhuǎn)入三角瓶，用1MOL/L醋酸溶液逐滴加入，調(diào)其PH值至50，然后迅速放入50℃的水浴中，保溫30MIN。在溫育過程中，注意經(jīng)常緩慢攪拌液體。之后在冰浴中迅速冷卻之，以12000R/MIN的轉(zhuǎn)速離心20MIN，棄去沉淀。留05ML上清液為第二組分。,3乙醇沉淀量出上清液的體積，加入等體積的95冷乙醇溶液預(yù)先放在20℃低溫下的時(shí)間不少于30MIN，于冰浴中溫和攪拌20MIN。然后以12000R/MIN的轉(zhuǎn)速離心25MIN，小心棄去上清液，沉淀瀝干。將沉淀溶解在6ML005MOL/LTRISHCL緩沖液PH值73中，攪拌5MIN以上使其完全溶解，以12000R/MIN的轉(zhuǎn)速離心25MIN，取出05ML上清液作為第三組分，剩余部分乙醇抽提液進(jìn)行第4步操作。,4上柱裝DEAESEPHAROSEFASTFLOW離子交換柱層析，用005MOL/LTRISHCL緩沖液PH值73平衡。將乙醇抽提液上柱，上樣后用005MOL/LTRISHCL緩沖液PH值73平衡，然后用005MOL/LTRISHCL緩沖液內(nèi)含05MOL/LNACL溶液，PH值73進(jìn)行NACL梯度NACL溶液濃度為005MOL/L洗脫。,層析柱連上梯度混合器，混合器分別裝30ML005MOL/LTRISHCL緩沖液PH值73和30ML含有05MOL/LNACL的005MOL/LTRISHCL緩沖液PH值73，每1MIN收集1管。洗脫至混合器中液體流完為止，測定各接收管在280NM下的光吸收值，并用尿糖試紙半定量測定各管的酶活力。收集酶活力最高的1管酶液作為第四組分用于純度測定。,5用尿糖試紙進(jìn)行半定量測定在白瓷板每孔中分別滴3滴待測酶液，再加3滴含10％蔗糖的PH45的醋酸緩沖液，攪勻，37℃放置10MIN，浸入尿糖試紙，1S后取出，60S后比較顏色的深淺，與比色卡對照。,6DNS法精確檢測,,試劑配制,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制（1MG/ML）預(yù)先將分析純葡萄糖置80℃烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取500MG葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至500ML容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4℃保存期約一星期）。醋酸BUFFER02MOL/L稱取328G無水乙酸鈉，溶解于150ML蒸餾水，用冰乙酸調(diào)節(jié)其PH至45，然后定溶至200ML。10蔗糖溶液10G蔗糖溶解于醋酸BUFFER02MOL/L中，定容至100ML1MOL/LNAOH溶液4GNAOH溶解于100ML蒸餾水中,四、結(jié)果分析以梯度洗脫出的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度A280、酶活、NACL濃度為縱坐標(biāo)，繪出層析曲線和酶活曲線圖。五思考題離子交換纖維素層析的優(yōu)點(diǎn)有哪些有機(jī)溶劑抽提蛋白質(zhì)的原理是什么,數(shù)據(jù)處理,REVIEWTOTALACTIVITYSPECIFICACTIVITYHOWTOCALCULATEIT,WHATITMEANS,HOWITCHANGESDURINGAPURIFICATIONFOLDPURIFICATIONWHATITIS,HOWTOCALCULATEITYIELDWHATITIS,HOWTOCALCULATEIT,HOWITCHANGESDURINGAPURIFICATION,兩重要概念,1回收率是純化后的總活力除以純化前的總活力2純化倍數(shù)是純化后的比活力除以純化前的比活力（第一次的比活力）注比活力比活力＝活力單位數(shù)／MG蛋白,實(shí)驗(yàn)二SDSPAGE電泳,一、實(shí)驗(yàn)步驟1試劑配制,（1）丙烯酰胺和N,N’亞甲雙丙烯酰胺。以溫?zé)幔ɡ谌芙怆p丙烯酰胺）的去離子水配制含有29（W/V）丙烯酰胺和1（W/V）N,N’亞甲雙丙烯酰胺的貯存液。,（2）15MTRIS，PH88（分離膠緩沖液）15MTRISHCL，04SDS（3）05MTRIS，PH68（濃縮膠緩沖液）05MTRISHCL，04SDS（4）10過硫酸銨,以上先配,等待凝膠聚合時(shí)再配（8）TRIS甘氨酸電泳緩沖液PH830025MTRIS，0192M甘氨酸，01SDS（9）樣品處理液50MMTRISHCLPH68，100MMDTTOR5巰基乙醇，2SDS，01溴酚藍(lán)，10甘油,（10）染色液01考馬斯亮藍(lán)R250，40甲醇，10冰醋酸（11）脫色液10甲醇，10冰醋酸,2SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制,（1）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板（2）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。,（3）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注濃縮膠所需空間梳子的齒長再加05CM。再在膠液面上小心注入一層水（約23MM高），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。（4）分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。,（5）制備濃縮膠按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。,（6）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。（7）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對樣品進(jìn)行處理，在樣品中按11體積比加入樣品處理液，在100℃加熱3分鐘以使蛋白質(zhì)變性。,（8）濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入TRIS甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。,3樣品的處理,將100UL蛋白樣品與100UL樣品處理液混合均勻，然后將此混合液在100攝氏度中水浴10MIN，冷卻至室溫后，12000RPM離心10分鐘，即做成電泳樣品。,4加樣電泳,（1）按予定順序加樣，加樣量通常為10～25ΜL（15MM厚的膠）。（2）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/CM。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/CM，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1CM，然后關(guān)閉電源。,,（3）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。,5染色經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)R250染色。染色1～2小時(shí)或過夜。,6脫色,需3～10小時(shí)，其間更換多次脫色液至背景清楚脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內(nèi)而不降低染色強(qiáng)度。為永久性記錄，可對凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。此方法檢測靈敏度為02～10G。,二結(jié)果分析,觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷酶的純度，拍出電泳酶純度的檢驗(yàn)結(jié)果。,實(shí)驗(yàn)三酵母蔗糖酶的結(jié)晶（蒸發(fā)和沉淀法相結(jié)合的懸滴蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法）,一、原理將含有一定鹽濃度的緩沖液與含有低于這種鹽濃度的蛋白質(zhì)混合溶液在一個(gè)密封體系內(nèi)一起蒸發(fā)擴(kuò)散，最后達(dá)到平衡，使蛋白質(zhì)溶液內(nèi)鹽濃度提高，而PH值接近待結(jié)晶蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的緩沖液又使中性鹽對蛋白質(zhì)的鹽析作用更為顯著，因此導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，溶液逐漸達(dá)到過飽和而析出結(jié)晶。,二、實(shí)驗(yàn)步驟,1用“吹氣法”除去酒精泡洗后的24孔組織培養(yǎng)板和蓋玻片上可能帶有的灰塵，以防形成不必要的成核中心而影響晶體的觀察。,2在24孔組織培養(yǎng)板的某孔中加入1ML含02MOL/LNACL的磷酸緩沖液（PH65）作為池液,孔邊緣均勻涂抹上高真空油脂，勿使其進(jìn)入孔內(nèi)。,3吸取1ΜL待結(jié)晶酶蛋白溶液置蓋玻片中央,加等體積池液至此液滴中，用槍頭輕輕地的吹吸液滴以保證混合液的均勻性并避免氣泡出現(xiàn)。,4小心、迅速地翻轉(zhuǎn)蓋玻片并蓋在培養(yǎng)板的孔上,旋轉(zhuǎn)45度以保證密封良好。5室溫下靜置狀態(tài)培養(yǎng)一周以上。,三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果一周后于體視鏡下觀察酵母蔗糖酶的晶體結(jié)構(gòu)。,實(shí)驗(yàn)四蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究,,一、實(shí)驗(yàn)原理,酶學(xué)性質(zhì)的研究包括最適溫度、最適PH、米氏常數(shù)、激活劑、抑制劑等。一般通過單因素實(shí)驗(yàn)確定。,二、實(shí)驗(yàn)步驟,配如下溶液02MOL/L磷酸氫二鈉02MOL/L乙酸鈉02MOL/L檸檬酸02MOL/L乙酸02MOL/L磷酸二氫鈉,1、最適PH的測定（1）按下表配制緩沖溶液將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10ML，其溶液PH值以酸度計(jì)測量值為準(zhǔn)。,（2）準(zhǔn)備二組各7支試管，第一組7支試管每支都加入02ML上表中相應(yīng)的緩沖液，然后加入一定量的蔗糖酶。另一組7支試管也是每支都加入02ML上表中相應(yīng)的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時(shí)的空白對照管。所有的試管都用水補(bǔ)足到08ML。,4米氏常數(shù)（KM）的測定,6DNS法精確檢測,,（3）所有的試管按一定時(shí)間間隔加入02ML蔗糖（02MOL/L開始反應(yīng)，反應(yīng)10MIN后分別加入1ML1MOL/LNAOH終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ML，沸水浴精確反應(yīng)5MIN,冷卻后定容至20ML，然后測定A540的吸光值。,2、最適溫度的測定測定室溫、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應(yīng)速度。每個(gè)溫度準(zhǔn)備1支試管，以乙酸緩沖液作為緩沖液。,6DNS法精確檢測,,（1）確定酶的稀釋倍數(shù)，試管中加入02ML02MOL/LPH45的乙酸緩沖液，02ML稀釋的酶，加水至08ML加入1ML10的蔗糖開始計(jì)時(shí)，在室溫下反應(yīng)10MIN，后分別加入1ML1MOL/LNAOH終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ML，沸水浴精確反應(yīng)5MIN,冷卻后定容至25ML，然后測定A540的吸光值。須得到02～03A的吸光度，準(zhǔn)備一個(gè)水的空白對照管用于測定所有的樣品管。,（2）測定上列各個(gè)溫度下的反應(yīng)速度，每次用1支試管，均加入02ML乙酸緩沖液均用水調(diào)至08ML，放入水浴溫度下使反應(yīng)物平衡30秒，加入10蔗糖02ML，準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，后分別加入1ML1MOL/LNAOH終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ML，沸水浴精確反應(yīng)5MIN,冷卻后定容至25ML，然后測定A540的吸光值。記錄每個(gè)水浴的準(zhǔn)確溫度。,（3）酶催化的各管A540值均進(jìn)行酸催化的校正。畫出酶催化的反應(yīng)速度對溫度的關(guān)系曲線。,3變性劑乙醇對游離酶活力的影響,4米氏常數(shù)（KM）的測定,三、結(jié)果分析,1畫出蔗糖酶活性與PH的關(guān)系曲線。2畫出酶催化的反應(yīng)速度對溫度的關(guān)系曲線。3畫出乙醇對酶催化的反應(yīng)速度影響的曲線。4采用雙倒數(shù)作圖法得出蔗糖酶的KM值。,實(shí)驗(yàn)四蔗糖酶的固定化,一、實(shí)驗(yàn)原理,本實(shí)驗(yàn)用殼聚糖固定化酵母蔗糖酶屬共價(jià)偶聯(lián)法。為了評價(jià)固定化方法的好壞，需進(jìn)行酶回收率和酶相對活力的計(jì)算。,實(shí)驗(yàn)步驟,1殼聚糖載體的制備及戊二醛的偶聯(lián)（1）稱取3G殼聚糖溶于98ML蒸餾水中，攪拌均勻，再滴加2ML冰醋酸，攪拌至均勻的粘稠狀；（2）稱取8GNAOH置大燒杯中，加入180ML蒸餾水及20ML甲醇。,（3）將拔出推塞的注射器架在鐵架臺(tái)上，倒入粘稠狀的殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液從20CM高的注射器出口滴入大燒杯中，以制備殼聚糖微球載體。,（4）殼聚糖溶液滴加完畢后，靜止片刻，待微球完全沉入燒杯底部時(shí)，反復(fù)水洗多次至PH值中性，瀝干水分。加入1戊二醛溶液100ML，靜置2H，使戊二醛偶聯(lián)于殼聚糖載體上。,2固定化酶的制備（1）將靜置2H后的殼聚糖微球載體中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸餾水洗滌5次，以除去多余的戊二醛。（2）將實(shí)驗(yàn)一純化得到的酵母蔗糖酶酶液1ML用蒸餾水稀釋至100ML,與偶聯(lián)戊二醛的殼聚糖載體混合，靜置偶聯(lián)過夜。,3固定化酶的評價(jià)分別測游離酶、固定化酶以及殘留酶液的酶活力。,三結(jié)果分析,酶活回收率,,,固定化酶活力,游離酶總活力,100,酶的相對活力,,,固定化酶活力,游離酶活力殘留酶液活力,100,實(shí)驗(yàn)五蔗糖酶的化學(xué)修飾,一、實(shí)驗(yàn)原理,N溴代琥珀酰亞胺（NBS）能特異地修飾蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基的吲哚基團(tuán)。若色氨酸殘基是酶活性中心的必需基團(tuán)，那么經(jīng)NBS修飾后，酶活性喪失的程度與修飾劑的濃度有化學(xué)計(jì)量關(guān)系。,在底物存在的情況下，修飾劑NBS不影響酶的活力。,P,,,,,,,,,,NH,,,,,,,,,,,,,,N,,BR,,,,,O,O,,P,,,,,,,,,NH,,,,,,,,,,,N,,,O,,,,,,OH,HBR,吲哚基團(tuán)N溴代琥珀酰亞胺羥吲哚衍生物,氧化,PH45,二、實(shí)驗(yàn)步驟,取8只試管，編號(hào)，按下表操作,三、結(jié)果分析,以NBS濃度為橫坐標(biāo)，相對活力為縱坐標(biāo)繪制折線圖，并分析不同濃度的NBS對酵母蔗糖酶活力的影響，得出結(jié)論。,
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簡介：第十章微生物與基因工程,基因工程技術(shù),基因工程（GENETICENGINEERING把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而得到大量基因產(chǎn)物，或令生物表現(xiàn)出新的形狀。,基因工程大事記,1973COHEN和BOYER第一次將重組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆1978GENENTECH公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物1982第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚,1993基因工程西紅柿在美國上市2019英國羅斯林研究所克隆羊多莉20199中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃,負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的12000626科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2019211公布人類基因組基本信息,第一節(jié)基因工程概述,三項(xiàng)重要技術(shù)為基因工程奠定了基礎(chǔ)19671970年RYUAN和HOSMITH等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年BERG等將SV40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功；1973年COHEN和BOYER第一次將重組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆1977年BOYER等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；19751977年SANGER、MAXAM和GILBERT先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測定法；90年代全自動(dòng)核酸序列測定儀的問世；,一、基因工程基本過程,1、目的基因的提取分離或合成外源基因。2、體外重組外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重組DNA分子；3、轉(zhuǎn)化重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。4、擴(kuò)增該克隆DNA。5、篩選與鑒定；6、基因表達(dá)控制適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)。7獲得表達(dá)產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物。,一切基因工程操作都離不開微生物1、基因工程所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成的。2、基因工程所用千余種工具酶是從微生物中得到的。3、微生物細(xì)胞是基因克隆的宿主。4、大規(guī)模表達(dá)基因產(chǎn)物，構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)。5、提供基因資源（抗高溫、高鹽、高堿、低溫等特性）。6、模式生物提供基礎(chǔ)理論。,二、微生物與基因工程關(guān)系,第二節(jié)基因的分離合成和誘變,利用重組DNA技術(shù)，可將某一原核生物或真核生物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群體）構(gòu)成的基因文庫GENOMICLIBRARY或CDNA文庫CDNALIBRARY,1基因文庫的構(gòu)建,所謂基因文庫是指生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。文庫中的每一個(gè)克隆只含基因組中某一特定的DNA片段。一個(gè)理想的基因文庫應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。,2、基因文庫的構(gòu)建步驟（1）從組織或細(xì)胞提取基因組DNA；（2）用限制性酶部分水解或機(jī)械剪切成適當(dāng)長度的DNA片段，經(jīng)分級分離選出一定大小合適克隆的DNA片段；（3）選擇容載量較大的克隆載體，通常采用Λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒載體，在適當(dāng)位點(diǎn)將載體切開；（4）將基因組DNA片段與載體進(jìn)行體外連接；（5）重組體DNA直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌或用體外包裝的重組Λ噬菌體顆粒感染敏感細(xì)菌細(xì)胞。最后得到攜帶重組DNA的細(xì)菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫。,2CDNA文庫構(gòu)建,所謂CDNA文庫是指生物體全部MRNA的CDNA克隆總體。CDNA文庫中的每一個(gè)克隆只含一種MRNA信息。由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構(gòu)建基因文庫的庫容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣一個(gè)事實(shí)，即細(xì)胞中的MRNA分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)小得多（通常大約僅有15左右基因被表達(dá)），因而若由MRNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，那么所構(gòu)建的CDNA文庫的庫容量相應(yīng)比基因文庫小。,構(gòu)建CDNA文庫的主要步驟①從生物體或細(xì)胞中提取MRNA。②利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚DT或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合成CDNA的第一條鏈。③利用DNA聚合酶I，以CDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成CDNA第二條鏈常用RNA酶H在雜交分子的MRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物或是除去雜交分子的MRNA后，加入隨機(jī)引物，即可合成第二條鏈。④CDNA與載體的體外連接。⑤噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于CDNA不含基因的啟動(dòng)子和內(nèi)含子，因而序列比基因短，其克隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。,基因的化學(xué)合成,DNA的合成自DNA合成儀問世后，化學(xué)合成已可完全自動(dòng)化，在半個(gè)小時(shí)內(nèi)可合成3035個(gè)堿基的寡核苷酸。目前化學(xué)合成寡核苷酸片段的長度約為150200個(gè)核苷酸左右。,PCR擴(kuò)增技術(shù)的原理和應(yīng)用,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（POLYMERASECHAINREACTION,PCR），是一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的新技術(shù)。BBIOO/VIDEO/2019/351HTM,如果DNA片段兩端的序列是已知的，則先要合成一對寡聚核苷酸引物，它們各自與所需擴(kuò)增的靶DNA片段的末端互補(bǔ)。PCR由3個(gè)基本反應(yīng)組成。①變性加熱，模板DNA經(jīng)熱變性，成為兩條單鏈；②退火使溫度下降，寡核苷酸引物即與模板DNA中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對；③延伸在適宜條件下引物3‘端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。DNA片段以2的指數(shù)增長，重復(fù)2530次循環(huán)，擴(kuò)增的DNA片段拷貝數(shù)可增至106107倍。,PCR擴(kuò)增技術(shù)原理,PCR技術(shù)的實(shí)際用途,①可用于DNA的擴(kuò)增和克隆，制備單鏈或雙鏈DNA探針；也可用于定位誘變和DNA測序。②在臨床醫(yī)學(xué)上可用于檢測病原體，診斷遺傳病，以及對癌基因的分析確定。③用于法醫(yī),以鑒別個(gè)體和判定親緣關(guān)系。,基因誘變,寡核苷酸介導(dǎo)的突變盒式誘變PCR介導(dǎo)的突變,第三節(jié)微生物與克隆載體,載體克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體克隆載體外源DNA片段進(jìn)行克隆，需要一個(gè)合適的載體，將其運(yùn)送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。這種以擴(kuò)增外源DNA為目的載體，稱為克隆載體。,克隆載體應(yīng)具備的性質(zhì),1、可獨(dú)立自主復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)；2、具有若干限制酶單一切割位點(diǎn)，且位于載體復(fù)制的非必需區(qū)，以便插入外源基因后不影響復(fù)制。3、有可供選擇的遺傳標(biāo)記（抗性基因、顯色反應(yīng)），以便于對陽性克隆的鑒別和篩選。4、具有一定安全性，在胞內(nèi)不發(fā)生重組與轉(zhuǎn)移，在胞外不發(fā)生不能自由擴(kuò)散。,目前克隆載體種類,質(zhì)粒載體Λ噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體M13噬菌體載體真核細(xì)胞的克隆載體人工染色體。,一、質(zhì)粒載體,1、特點(diǎn)（1）具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)；（2）具有較小的相對分子質(zhì)量。1－200KB，外源DNA≤15KB；（3）具有較高拷貝數(shù)，多為松馳控制型。人為增加拷貝數(shù)可用終濃度10－20ΜG/ML，氯霉素停止細(xì)胞蛋白合成，宿主DNA合成終止，質(zhì)粒復(fù)制正常進(jìn)行，可達(dá)數(shù)千個(gè)拷貝；（4）具有便于選擇的標(biāo)記；（5）易于導(dǎo)入細(xì)胞，質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化和電穿孔等方法導(dǎo)入細(xì)胞；（6）具有限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)。,PBR322的結(jié)構(gòu)特征,環(huán)狀雙鏈DNA分子，由4361BP組成，松馳型COLEⅠ復(fù)制起點(diǎn)，外源DNA大小為5KB左右四環(huán)素抗性基因（TETR）、氨芐青霉素抗性基因（AMPR）24單一酶切位點(diǎn)（TETR中7個(gè)，AMPR中3個(gè)）。,二、Λ噬菌體克隆載體,Λ噬菌體克隆載體的構(gòu)建,野生型ΛDNA包裝的上限為505KB，本身長度為485KB，插入片段至多為20KB，如果將其縮短便能夠提高裝載量。插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行，而天然的ΛDNA上有許多重復(fù)的酶切口，如ECORI5個(gè)，HINDIII7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除,I插入型載體,經(jīng)改造后的長度為37KB，為包裝的下限，插入片段最大為135KB（50537KB）由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。,II取代型載體,經(jīng)改造后的長度約為40KB，含兩個(gè)酶切口，兩者間的距離為14KB，然后用外源DNA片段取代之。包裝下限為37KB，這類載體不需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體DNA只有26KB，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去。,Λ噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn),可在體外包裝成噬菌體，高效感染大腸桿菌裝載外源DNA的量大（≤23KB）重組ΛDNA的篩選提取方便Λ噬菌體載體常用于構(gòu)建基因文庫。,三、M13噬菌體載體,1、M13噬菌體基本特點(diǎn)（1）M13噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂；（2）M13噬菌體的基因組為單鏈DNA，由6407的堿基組成；（3）在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈DNA，用于DNA的復(fù)制，因此這種雙鏈DNA稱為復(fù)制型DNA（REPLICATIVEFORMDNA），即RFDNA；,利用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個(gè)重要意義。第一，它促進(jìn)了對真核生物復(fù)雜基因組及其基因調(diào)控的研究；第二，它有利于真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工。釀酒酵母是一種理想的真核生物克隆載體宿主。,四、真核生物的克隆載體,1酵母質(zhì)粒載體酵母質(zhì)粒載體都是利用其2ΜM質(zhì)粒和其酵母染色體組分與細(xì)菌質(zhì)粒PBR322構(gòu)建而成的。可分別在細(xì)菌、酵母中復(fù)制，又稱穿梭質(zhì)粒。主要有三種附加體質(zhì)粒、復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒,,（1）附加體質(zhì)粒（EPISOMALPLASMID）,①結(jié)構(gòu)PBR322的復(fù)制起點(diǎn)、AMPR（氨芐青霉素抗性基因）；2ΜM的復(fù)制起點(diǎn)；酵母選擇標(biāo)記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3）。②細(xì)胞中拷貝數(shù)酵母中高拷貝數(shù)。,（2）復(fù)制質(zhì)粒,含有來自細(xì)菌質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（AMPR）和四環(huán)素抗性基因（TETR）。來自酵母染色體的自主復(fù)制序列（ARS）；作為酵母選擇標(biāo)記的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1）。這種質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌或酵母細(xì)胞中復(fù)制，重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中可獲得中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。,（3）整合質(zhì)粒,含有來自PBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（AMPR）、四環(huán)素抗性基因（TETR）。來自酵母的URA3基因；它既可以作為酵母細(xì)胞的選擇標(biāo)記，也可與酵母染色體DNA進(jìn)行同源重組。這種質(zhì)粒可在大腸桿菌中復(fù)制，但不能在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制。一旦導(dǎo)入酵母細(xì)胞，可整合到酵母染色體上，成為染色體DNA的一個(gè)片段。,2真核生物病毒載體,（1）哺乳動(dòng)物病毒載體目前利用許多哺乳動(dòng)物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。（2）昆蟲病毒載體主要為高克隆容量（100KB）；其次具有高表達(dá)效率（25％）；安全，僅感染無脊椎動(dòng)物；（3）植物病毒載體,五、人工染色體,酵母人工染色體（YAC）能容納最大外源DNA片段。1、組成著絲粒（CENTROMERE，CEN）、端粒（TELOMERE，TEL）、酵母自主復(fù)制序列（ARS）、選擇性標(biāo)記（如URA3）。2、功能大片段克?。?00萬BP），多用于真核生物基因庫的載體。3、相關(guān)細(xì)菌人工染色體（BAC）。,常用工具酶種類內(nèi)切酶把DNA長鏈切割為短的片段連接酶將2段DNA片段拼接起來聚合酶催化合成形成核酸鏈末端轉(zhuǎn)移酶片段末端加接多聚核苷酸核酸酶水解酶，非專一性反向轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶,第四節(jié)微生物與基因工程工具酶,一、限制性內(nèi)切酶,1、限制性內(nèi)切酶的定義是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個(gè)組成部分，具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶。,限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),LURIA和HUMAN發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來的DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不被外來噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制－修飾。SMITH和WILCOX從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶被命名為HINDI,這是第一個(gè)分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。,3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名,按酶來源菌的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如從流感嗜血桿菌D株（HAEMOPHILUSINFLUENZAED）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HINDⅠ、HINDⅡ和HINDⅢ。,4、限制性內(nèi)切酶的類型,限制性內(nèi)切酶可分為三大類型類型I和類型III由于識(shí)別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少被應(yīng)用。類型II的特點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一；識(shí)別序列的堿基數(shù)一般為4、6、8個(gè)BP；識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)常是一種回文序列的DNA；是DNA重組技術(shù)最為常用的工具酶。,寡核苷酸順序具有二沖旋轉(zhuǎn)對稱軸，又稱為回文順序（PALINDROMICSEQUENCE）GAATTCCTTAAG也有一些對稱順序被一個(gè)或幾個(gè)非特定的核苷酸間隔開。N四種均可PY嘧啶PU嘌呤如GTPYPUACHINDI,6、限制性內(nèi)切酶的切割方式,就切割位點(diǎn)相對于對稱軸的位置而言,切割方式有三種在對稱軸5側(cè)切割產(chǎn)生5粘端在對稱軸3側(cè)切割產(chǎn)生3粘端在對稱軸處切割產(chǎn)生平端,二、DNA連接酶,配對的堿基產(chǎn)生的氫鍵還不足以把兩個(gè)DNA分子拴在一起，還需要通過DNA連接酶在3’羥基和5’磷酸基團(tuán)之間形成新的磷酸二酯鍵。大多數(shù)DNA連接酶都是從T4噬菌體中分離出來的，它可以催化在兩條DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵，包括粘性末端堿基配對的兩條DNA鏈和末端都是平末端的兩條DNA鏈,其它常用工具酶,3TAGDNA聚合酶是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有5’→3’聚合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為7580℃，主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng)。,4逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）主要作用是將MRNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA,（二）堿性磷酸酶,其作用是去除DNA、RNA的5’磷酸根（5’P），以防自身環(huán)化；另外在用32P標(biāo)記5’末端前，可先用其去除DNA或RNA上的5’P,（三）核酸酶,S1核酸酶主要用于去除DNA片段粘末端而產(chǎn)生平端；打開CDNA中發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其成平端。核糖核酸酶（RNASEA在質(zhì)粒提取時(shí)降解RNA；從DNARNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。,第五節(jié)外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞,二、克隆載體對宿主的要求,一、宿主的基本要求與性質(zhì)1、能夠高效吸收外源DNA；2、根據(jù)載體的類型和標(biāo)記選擇合適宿主，例M13噬菌體載體，選擇含有F因子雄性大腸桿菌；Λ噬菌體載體，選擇ECOLIK12。3、不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會(huì)使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；4、一般為重組缺陷型（RECA）菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；5、安全需嚴(yán)格限制載體的宿主范圍，以達(dá)到盡量避免重組體從實(shí)驗(yàn)室逃逸出去。,1、外源DNA導(dǎo)入導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；外源DNA構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌質(zhì)粒，則可通過轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入宿主細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞用氯化鈣處理宿主細(xì)胞，使細(xì)胞變得易于吸引外源DNA。（2）ΛDNA的侵染（體外包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)）體外包裝（將重組DNA分子與Λ噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，組裝成具感染力的Λ噬菌體粒子）感染宿主。較轉(zhuǎn)染效率要高出104－105倍。,三、外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞,,2、外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（1）外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞（轉(zhuǎn)化）,酵母細(xì)胞,原生質(zhì)體,蝸牛酶,CACL2和聚乙二醇,復(fù)合體（含DNA的原生質(zhì)體）,,,長出有壁細(xì)胞,再生培養(yǎng)基中,,（2）外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞其中最簡便的是微量注射法和電穿孔法。（3）外DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞除了微量注射法及電穿孔法可將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞外。還有兩種方法，一種是基因槍法或稱微彈槍法；另一種是將含有重組TI質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片培養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法）。,1載體選擇標(biāo)記的鑒定,1抗生素平板法2插入失活法3Β半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法,四、目的克隆的篩選與鑒定,抗生素平板法,,缺點(diǎn)假陽性高,插入失活法,因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活（INSERTIONALINACTIVATION）,Β半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法,蘭白斑篩選某些載體，如M13，PUC系列，PGEM質(zhì)粒系列等，都帶有LACZ’基因的一段序列，編碼Β–半乳糖苷酶的Α肽；而宿主細(xì)胞為LACZ△M15的突變株時(shí)，Α肽可與△M15進(jìn)行Α互補(bǔ)，產(chǎn)生具有活性的Β–半乳糖苷酶。若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代ΒD半乳糖苷IPTG和呈色物質(zhì)5溴4氯3吲哚ΒD半乳糖苷X–GAL培養(yǎng)基的平板上時(shí)，可形成藍(lán)色菌落。,當(dāng)外源DNA插入到這一區(qū)段，則會(huì)破壞Α互補(bǔ)作用。這時(shí)若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有IPTG和X–GAL培養(yǎng)基的平板上，則形成無色菌落。,2目的基因序列的鑒定,菌落（或噬菌斑）原位雜交（INSITUHYBRIDIZATION）內(nèi)切酶圖譜鑒定PCR鑒定,菌落（或噬菌斑）原位雜交,將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當(dāng)形成菌落或噬菌斑后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上。翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出DNA。再用堿處理，使DNA變性，經(jīng)烘烤將變性DNA固定于濾膜上。然后用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交，并經(jīng)放射自顯影，黑點(diǎn)代表雜交上的菌落，即可篩選到陽性克隆。,內(nèi)切酶圖譜鑒定,將初步篩選的陽性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用12種內(nèi)切酶酶切，然后進(jìn)行凝膠電泳，檢測插入DNA片段大小。,雙酶切鑒定重組質(zhì)粒,,,DNA序列測定,最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組體的DNA進(jìn)行序列測定,,表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測定,一般分析N末端（15個(gè)殘基序列）和C末端（一般5個(gè)）氨基酸鑒別蛋白質(zhì)的性質(zhì)和同質(zhì)性；,第六節(jié)外源基因在細(xì)菌中的表達(dá),基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌、酵母或動(dòng)、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動(dòng)、植物的遺傳性狀。所謂表達(dá)載體（EXPRESSIONVECTOR）是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。,1啟動(dòng)子（PROMOTER）,啟動(dòng)子是指RNA聚合酶結(jié)合于DNA并起始合成RNA的一段DNA控制序列。原核基因啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（TRANSCRIPTIONINITIATION）上游（左側(cè)），它由兩段彼此分開且又高度保守的核心序列組成。,一外源基因轉(zhuǎn)錄,原核表達(dá)系統(tǒng)中常用啟動(dòng)子,①LAC啟動(dòng)子，是乳糖操縱子的啟動(dòng)子，受LACI編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)控制；②TRP啟動(dòng)子，是色氨酸操縱子啟動(dòng)子，受TRPR編碼的阻遏蛋白調(diào)控；③TAC啟動(dòng)子，由LAC啟動(dòng)子的10區(qū)和TRP啟動(dòng)子35區(qū)融合而成，匯合了LAC和TRP兩者優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，同樣受LACI阻遏蛋白調(diào)控。④PL、R啟動(dòng)子，是Λ噬菌體左、右向啟動(dòng)子，其溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調(diào)控；⑤T7噬菌體啟動(dòng)子，比大腸桿菌啟動(dòng)子強(qiáng)得多且十分專一，只被T7RNA聚合酶所識(shí)別。,2轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)和控制,通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中。這是由于某些有價(jià)值的外源蛋白可能對宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白的過量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長；,宿主細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長直至獲得足夠量的細(xì)胞。第二階段是啟動(dòng)開關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同時(shí)高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價(jià)值的表達(dá)產(chǎn)物。外源基因表達(dá)常采用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)與溫度誘導(dǎo)兩種不同方法。,化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo),當(dāng)用LAC啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，LAC啟動(dòng)子受CAP蛋白和CAMP的正調(diào)控。受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控；當(dāng)宿主細(xì)胞生長時(shí)，LACI基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與LAC操縱基因結(jié)合，阻礙外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞大量生長和繁殖。加入誘導(dǎo)物IPTG后，由于誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其不能與操縱基因結(jié)合。于是，外源基因被誘導(dǎo)而高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。,溫度誘導(dǎo),當(dāng)用ΛPL、R啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，PL、R啟動(dòng)子受Λ噬菌體CI基因的負(fù)調(diào)控，CI基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合在操縱基因上，阻止轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。目前利用CI的溫度敏感突變基因（CI857TS）調(diào)節(jié)這種阻遏。當(dāng)在2830℃培養(yǎng)時(shí)，該突變體產(chǎn)生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R轉(zhuǎn)錄，細(xì)菌大量生長。在獲得足夠量菌體后，使溫度上升至42℃，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，啟動(dòng)外源基因的高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而合成大量有價(jià)值的外源蛋白。,轉(zhuǎn)錄終止子,轉(zhuǎn)錄終止子指一段位于基因或操縱子的３末端，具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定DNA序列。高效表達(dá)載體應(yīng)該含有終止子，因?yàn)楹铣傻腗RNA過長，不僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能量，且易使MRNA形成妨礙翻譯的二級結(jié)構(gòu)。,三外源基因表達(dá)產(chǎn)物,為了在原核細(xì)胞中表達(dá)非融合蛋白，可將帶有起始密碼子ATG的真核基因插入到合適的原核啟動(dòng)子和SD序列下游。經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，就可在原核細(xì)胞中，表達(dá)出非融合蛋白。,1非融合蛋白的表達(dá),2融合蛋白的表達(dá),所謂融合蛋白是指蛋白質(zhì)的N端由宿主基因（通常只是N端的部分序列）編碼，C端由外源基因編碼的蛋白質(zhì)，換言之，融合蛋白是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的雜合蛋白。,3外源蛋白的分泌表達(dá),分泌型表達(dá)載體除具有一般表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)外，還需要具有編碼信號(hào)肽的序列。通常信號(hào)肽與外源蛋白的N端連接，由于信號(hào)肽含有帶正電荷的氨基酸和疏水氨酸，故能攜帶表達(dá)蛋白越膜分泌到周質(zhì)或胞外，然后質(zhì)膜上的信號(hào)肽酶將信號(hào)肽切除。,4包涵體（INCLUSIONBODY）,當(dāng)外源蛋白在大腸桿菌高水平表達(dá)時(shí)，常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集而形成包涵體。利用大腸桿菌生產(chǎn)的非融合蛋白多數(shù)情況下以包涵體形式存在。形成包涵體有利于外源蛋白的高水平表達(dá)和防止蛋白酶對其的降解，也可避免外源蛋白對宿主細(xì)胞的毒害。此外也有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離。但包涵體形式的表達(dá)蛋白不具生物學(xué)活性，需要體外復(fù)性。,第七節(jié)基因工程的應(yīng)用,基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因治療在微生物研究中應(yīng)用,基因工程藥品胰島素,胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100KG胰腺只能提取4～5G胰島素。用該方法生產(chǎn)的胰島素產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)需要。1979年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產(chǎn)的胰島素投入市場，售價(jià)降低了30～50。,干擾素是病毒侵入細(xì)胞后產(chǎn)生的一種糖蛋白。干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一種抗病毒的特效藥。此外干擾素對治療某些癌癥和白血病也有一定療效。傳統(tǒng)的干擾素生產(chǎn)方法是從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取，每300L血液只能提取出1MG干擾素。1980～1982年，科學(xué)家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干擾素，是傳統(tǒng)的生產(chǎn)量的12萬倍。1987年上述干擾素大量投放市場。,基因工程藥品干擾素,基因工程藥品生長激素,治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素。現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當(dāng)于6萬具尸體的全部產(chǎn)量。,基因工程藥物的生產(chǎn)過程,1、目的基因的提取分離或合成外源基因。2、體外重組外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重組DNA分子；3、轉(zhuǎn)化重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。4、篩選與鑒定；5、基因表達(dá)控制適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)。6、表達(dá)產(chǎn)物的純化,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物指把人或哺乳動(dòng)物的某種基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物如鼠、兔、羊和豬的受精卵里，目的基因若與受精卵染色體DNA整合，細(xì)胞分裂時(shí)，該基因隨染色體的倍增而倍增，使每個(gè)細(xì)胞中都帶有目的基因，使性狀得以表達(dá)，并穩(wěn)定地遺傳給后代，從而獲得基因產(chǎn)品。這樣一種新的個(gè)體，稱為。,轉(zhuǎn)基因植物,1983年世界首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功，標(biāo)志著人類用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物的開始。1986年轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物獲得批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)1994年美國CALGENE公司培育的延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄被批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，2000年全世界轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種
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